Vitrifikasyon Tabanlı Kriyoprezervasyon: Biyolojik Örnekleri Uzun Süreli Depolama için Çok Düşük Sıcaklıklarda Korumak İçin Ultra Hızlı Bir Soğutma Tekniği

Özet

Kaynak: Lu, J. H. et al. Mide Kanseri Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin ve Primer Hücre Hatlarının Oluşturulması. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, biyolojik numuneleri korumak için ultra hızlı bir kriyo vitrifikasyon yöntemini gösteriyoruz. Yöntem, hücre içi buz kristali oluşumunu önleyerek biyolojik dokuyu donma hasarından korumak için kriyoprotektanların bir kombinasyonunun kullanılmasını gerektirir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Doku Kriyoprezervasyonu

NOT: Bu bölüm öncelikle Canlı Doku Kiti Cryo Kiti yöntemlerine atıfta bulunur. Ana kitler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Tümörün çapı 10 mm'den büyük olduğunda fareleri IRB onaylı bir yöntemle ötenazi yapın.
2. Steril forseps ve makas kullanarak, tümörü farelerden yavaşça izole edin.
3. Tümör dokularını DPBS ile 10 cm'lik bir tabakta yıkayın. Nekrotik alanları, yağ dokusunu, kan pıhtılarını ve bağ dokusunu forseps ve makasla inceleyin ve çıkarın.
4. Tümör dokularını bir kalıp ile en fazla 1 mm kalınlığında kesin.
5. Dilimleri DPBS ile 10 cm'lik bir tabakta yıkayın.
   not: Vitrifikasyon işlemi, adım 1.6-1.8'de V1/V2/V3 etiketli tüplerin kullanımını içerir. Ana bileşenler DMSO ve sakarozdur.
6. Dilimleri forseps ile V1 tüpüne aktarın ve tüpü 4 ° C'de 4 dakika inkübe edin. Tüpü kısa bir süre yuvarlayın ve ters çevirin ve 4 dakika daha 4 ° C'ye yerleştirin.
7. V1 çözeltisini dökün ve dilimleri 10 cm'lik bir tabağa koyun. Dilimleri forseps ile tüp V2'ye aktarın ve tüp V2'yi 4 °C'de 4 dakika inkübe edin. Tüpü kısa bir süre yuvarlayın ve ters çevirin ve 4 dakika daha 4 °C'ye yerleştirin.
8. V2 çözeltisini dökün ve dilimleri 10 cm'lik bir tabağa koyun. Dilimleri forseps ile V3 tüpüne aktarın ve tüpü 4 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Tüpü kısa bir süre yuvarlayın ve ters çevirin ve en az 5 dakika boyunca 4 °C'ye yerleştirin. Dilimlerin hepsinin tüpün dibine battığından emin olun.
   1. Birkaç dilim yüzer halde kalırsa, tüpü kısa bir süre yuvarlayın ve ters çevirin ve tüm dilimler tamamen batana kadar tüpü tekrar 4 ° C'ye yerleştirin; gerekirse, yüzen dilimleri atın.
9. V3 çözeltisini dökün ve dilimleri 10 cm'lik bir tabağa koyun.
10. Doku tutucuları uygun uzunlukta kesin ve steril gazlı bez üzerine yerleştirin. Dilimleri tutuculara aktarın. Tutucuları gazlı bezle sarın ve forseps kullanarak sıvı nitrojen içine yerleştirin, ardından 5 dakika inkübe edin.
11. Kriyojenik şişeleri doku bilgileriyle etiketleyin.
12. Doku dilimleri olan tutucuları sıvı nitrojen içinde depolanan kriyojenik şişelere aktarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Canlı Doku Kiti Cryo Kiti	Celliver Biyoteknoloji, Şangay, Çin	LT2601
Doku ile işlenmiş kalıplar ve yardımcı bıçaklar	Celliver Biyoteknoloji, Şangay, Çin	LT2603
DPBS (DPBS)	Basalmedia Technology, Şangay, Çin	L40601

Serisi Serisi Serisi