Peritoneal Düşük Yoğunluklu Nötrofil İzolasyonu: Manyetik Aktif Hücre Sıralaması Kullanılarak Peritoneal Lavaj Sıvısından Düşük Yoğunluklu Nötrofiller Elde Etme Tekniği

Bu makalede

Özet

Kaynak: Kanamaru, R. et al. Periton Lavaj Sıvısından Elde Edilen Düşük Yoğunluklu Nötrofiller Tarafından Üretilen Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar, Tümör Hücresi Büyümesine ve Bağlanmasına Aracılık Eder. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, düşük yoğunluklu nötrofillerin veya LDN'lerin ameliyat sonrası bir insan hastanın periton lavaj sıvısından izole edilmesi prosedürünü açıklıyoruz. Bu şekilde elde edilen LDN'ler, tümör büyümesi ve ilerlemesindeki rollerini anlamak için daha sonraki aşağı akış deneylerinde kullanılabilir.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Abdominal Kavite Lavajlarından LDN İzolasyonu

Numune alımı
1. Gastrointestinal malignite nedeniyle abdominal cerrahi geçiren hastalarda yara kapanmadan önce 1.000 mL normal steril salini doğrudan karın boşluğuna infüze edin.
  not: Yaş veya cinsiyete göre önyargısız olarak gastrektomi, kolektomi veya özofajektomi yapılan hastalardan örnekler alındı. Salin bir kaba aktarıldı ve bir dakika içinde tüm karın içine döküldü. Bu, hastalar üzerinde önemli bir etkisi olmaksızın ameliyat sonrası periton yıkama olarak rutin olarak gerçekleştirilir.
2. Karın boşluğunu en az 1 dakika boyunca yoğun bir şekilde lavaj yapın < > not: Numunelerin homojen olması için demlenen sıvının cerrahın elleriyle yavaşça karıştırılması önerilir.
3. Dört adet 50 mL şırınga ile 200 mL lavaj sıvısını geri kazanın.
  not: Bazen, sıvıları almak için bir kauçuk konektör kullanılır.
Granülosit spesifik mAb, CD66b
kullanarak peritoneal LDN'nin saflaştırılmasını gerçekleştirin not: Yoğunluk gradyan santrifüjlemesinden sonraki ara katman birçok mononükleer hücre içerdiğinden, CD66b mAb kullanılarak pozitif bir polimorf nötrofil seçimi gerçekleştirildi.
1. Periton lavaj sıvısını 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  not: Bu adımda, kirleri gidermek için sıvıları 100 μm'lik bir naylon filtreden geçirin.
2. Periton sıvısını RT'de 7 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin.
3. Peletleri% 0.02 EDTA ile 5 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
4. 5 mL hücre süspansiyonunu 3 mL yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine dikkatlice yerleştirin.
5. Herhangi bir ara vermeden RT'de 15 dakika boyunca 1.700 x g'da santrifüjleyin.
6. Bir pipet kullanarak ara katmanları (Şekil 1A) içeren bir çözeltiden yaklaşık 2 ila 3 mL hasat edin ve bunu% 0.02 EDTA ile 10 mL PBS ile karıştırın.
7. Periton sıvısını RT'de 7 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
8. % 0.02 EDTA ile 10 mL PBS daha ekleyin ve RT'de 7 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin.
9. Manyetik hücre ayırma kiti için hücre peletini (1 x 10⁷) 60 μL tamponda çözün.
10. Peletlere 20 μL Fc bloğu ekleyin ve 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
11. Mikro boncuklarla konjuge edilmiş 20 μL anti-CD66b ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika daha inkübe edin.
12. Peletleri 500 μL MACS tamponunda yıkayın ve yeniden süspanse edin.
13. Hücre süspansiyonunu uygun bir manyetik ayırıcının manyetik alanındaki bir manyetik kolona uygulayın ve kolonu 15 mL tampon ile yıkayarak akış içeren CD66b(-) hücrelerini toplayın.
14. Kolonu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve pistonu kolona sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş CD66b(+) hücrelerini hemen yıkayın.
  not: CD66b (+) hücre popülasyonu, FACS analizi ile belirlendiği üzere çoğunlukla nötrofillerden oluşur, bu da CD66 (+) fraksiyonunun% >95'inin CD11b, CD15 ve CD16 için pozitif, ancak CD14 için negatif olduğunu gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1
Şekil 1: Peritoneal LDN kültürü sonrası NET oluşumu. (Bir)Postoperatif lavaj sıvısının yoğunluk gradyanlı santrifüjünden sonra, ara tabakadan geri kazanılan hücreler gösterilir. (B) Daha sonra, CD66b (+) LDN, CD66b (-) mononükleer hücrelerden ayrıldı ve poli-L-lizin kaplı 6 oyuklu plakalar üzerinde kültürlendi, ardından nükleer boyama boyası ilavesi ve floresan mikrosk...