Nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin floresan mikroskobu: kanser hücreleri ve NET'ler arasındaki yapışkan etkileşimi gözlemlemek için bir teknik

Özet

Kaynak: Kanamaru, R. et al. Periton Lavaj Sıvısından Elde Edilen Düşük Yoğunluklu Nötrofiller Tarafından Üretilen Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar Tümör Hücresi Büyümesine ve Bağlanmasına Aracılık Eder. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, nötrofiller tarafından dışarı atılan hücre dışı DNA bileşenleri olan nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) floresan boyanmasını göstermektedir. Bu teknik, kanser hücreleri ve NET'ler arasındaki yapıştırıcı etkileşiminin görselleştirilmesini sağlar.

Protokol

1. Tümör Hücrelerinin Kırmızı Floresan Hücre Bağlayıcı Boya ile Boyanması

1. İnsan kanser hücre hatları MKN45, NUGC ve OCUM-1'i hazırlayın.
2. 15 mL'lik bir tüpte 1 x 10⁷ hücreyi PBS +% 0.02 EDTA ile yıkayın ve RT'de 7 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin.
3. Peletlere boya lekesi için 1 mL çözelti ekleyin ve nazikçe pipetleyin.
4. Boyama için 4 μL Kırmızı Floresan Hücre Bağlayıcı boyayı 1 mL çözelti içinde çözün ve adım 1.2'den itibaren hücre süspansiyonu ile karıştırın.
5. Peletleri RT'de 4 dakika inkübe edin.
6. Boyama reaksiyonunu durdurmak için 4 mL DMEM (% 10 FBS) ekleyin.
7. 270 x g'yi 7 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
8. 1.6 ve 1.7 adımlarını iki kez tekrarlayın.
9. Floresan mikroskobu (uyarma = 551 nm, yayma = 567 nm) ile tümör hücrelerinin kırmızıya boyandığını kontrol edin.

2. Tümör Hücresinin NET'lere Yapışmasının Analizi

1. Düşük yoğunluklu nötrofil hücrelerini, nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin üretimini sağlayan% 5 CO₂ içinde 37 ° C'de 2 saat boyunca 6 oyuklu poli-L-lizin kaplı bir plakada (6 cm çapında) kültürleyin
2. Kırmızı floresan lekeli tümör hücrelerini (1 x 10,⁶)% 0.1 BSA ile desteklenmiş 1 mL RPMI 1640 içinde aktarın.
3. Tümör hücrelerini, NET'leri üreten LDN kültürüne ekleyin.
4. 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin, bu da tümör hücrelerinin NET'lerle temas etmesini sağlar.
   not: Uzun inkübasyon, tümör hücresinin LDN'ye veya plakalara yapışmasını indükler.
5. Ortamı çıkarın ve 2 mL önceden ısıtılmış ortam (%0,1 BSA + RPMI 1640) ekleyerek ve tabağı döndürerek kuyuları nazikçe yıkayın.
6. Adım 2.5'teki yıkama işlemini iki kez tekrarlayın.
   not: NET'ler plakaya zayıf bir şekilde yapıştığından, NET'lerin kendilerinin çıkarılmasını önlemek için yıkama mümkün olduğunca nazikçe yapılmalıdır.
7. NET'lerin görselleştirilmesi için çekirdeği ve kromozomları 5 μg/mL'lik son konsantrasyonda boyamak için yeşil floresan boya ekleyin.
8. Uygun filtreleri kullanarak NET'leri ve bağlı tümör hücrelerini gözlemleyin (yeşil, uyarma = 504 nm, yayma = 523 nm; kırmızı, uyarma = 551 nm, yayma = 567 nm).
9. NET'ler tarafından yakalanan tümör hücrelerini göstermek için şekilleri birleştirin.
   not: Bazı deneylerde, DNA bozunma enzimi, 5 dakika boyunca birlikte inkübasyondan 5 dakika önce LDN kültürüne (100 U / mL'lik nihai konsantrasyon) eklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SYTOX yeşil nükleik asit boyası DMSO'da 5 mM çözeltisi	Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD	S7020 Serisi
Genel Hücre Zarı Etiketleme için PKH26 Kırmızı Floresan Hücre Bağlayıcı Kiti	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	P9691 Serisi
RPMI1640 Orta	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	R8758 Serisi
Sığır Serumu Albümin liyofilize toz, %≥96 (agaroz jel elektroforezi)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	A2153
Poli-L-Lizin Kaplı MİKROPLAKA 6Kuyu	IWAKI, Japonya	4810-040
Floresein stereomikroskop	BX8000, Keyence, Osaka Japonya	BZ-X710
MKN45 insan mide kanseri hücre hattı	Riken, Tukuba Japonya	Yok
NUGC-4 insan mide kanseri hücre hattı	Riken, Tukuba Japonya	Yok
OCUM-1 insan mide kanseri hücre hattı	Osaka Şehir Üniversitesi, Japonya	Yok	Dr. M. Yashiro'nun Hediyesi
DNaz I	Worthington, Lakewood, NJ	LS002138
0,5 mol/l-EDTA Çözeltisi (pH 8.0)	Nacalai tesque, Japonya	06894-14
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta-yüksek glikozu (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	D5796