Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların veya NET'lerin Hızlandırılmış Floresan Mikroskobu: Kanser Hücreleri ve NET'ler Arasındaki Yapışma Sonrası Etkileşimi Analiz Etmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Kanamaru, R. et al. Periton Lavaj Sıvısından Elde Edilen Düşük Yoğunluklu Nötrofiller Tarafından Üretilen Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar, Tümör Hücresi Büyümesine ve Bağlanmasına Aracılık Eder. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, düşük yoğunluklu nötrofiller ve mide kanseri hücrelerini birlikte kültürleyerek nötrofil hücre dışı tuzaklarda (NET'ler) hapsolmuş kanser hücrelerinin yapışma sonrası davranışını analiz ediyoruz. Hızlandırılmış video analizi, çeşitli hücresel olayların izlenmesine ve NET'lerin patolojik durumlardaki rolünün incelenmesine yardımcı olur.

Protokol

1. Sıkışan Tümör Hücrelerinin Hızlandırılmış Video Analizi

1. Peritoneal LDN'leri poli-L-lizin ile kaplanmış 35 mm'lik yuvarlak bir tabakta kültürleyin ve% 5 CO₂ içinde 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
2. 5 μM'lik son konsantrasyonda NET'leri görselleştirmek için çekirdeği ve kromozomları boyamak için yeşil floresan boyayı ekleyin.
3. 1 dakikalık inkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve 2 mL% 0.1 BSA + RPMI 1640 ekleyin.
4. Ortamı çıkarın ve %0,1 BSA + RPMI 1640'ta asılı lekesiz 1 x^{10 6} MKN45 hücresi ekleyin. RT'de 5 dakika inkübe edin.
5. 2 mL önceden ısıtılmış ortam (%0,1 BSA + RPMI 1640) ekleyerek ve kabı döndürerek bulaşığı nazikçe yıkayarak bağlanmamış tümör hücrelerini çıkarın.
6. Yukarıdaki yıkama işlemini iki kez tekrarlayın.
   not: NET'ler plakaya zayıf bir şekilde yapıştığından, NET'lerin kendilerinin çıkarılmasını önlemek için yıkama mümkün olduğunca nazikçe yapılmalıdır.
7. 100 u/mL Penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş% 10 FCS ile DMEM ekleyin.
8. Kültür çanağını tam görünümlü bir hücre gözlem sistemine monte edin ve tümör hücrelerinin NET'ler tarafından yakalandığı uygun alanı seçin.
9. İki gün daha birlikte kültüre devam edin ve sırasıyla MKN45 hücrelerini ve NET'leri algılayan normal ışık ve floresan altında her 6 dakikada bir alanın sürekli fotoğraflarını çekin.
10. Görüntüleri her zaman noktasında üst üste getirin ve Image Viewer yazılımını kullanarak hızlandırılmış videolar oluşturun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMSO'da SYTOX yeşil nükleik asit lekesi 5mM çözeltisi	Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD	S7020 Serisi
RPMI1640 Orta	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	R8758 Serisi
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta-yüksek glikozu (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	D5796
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	D8537
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, USDA onaylı bölgeler	gibco by life technologies, Meksika	10437-028
Sığır Serum Albümini liyofilize toz, %≥96 (agaroz jel elektroforezi)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	A2153
Penisilin Streptomisin	Yaşam Teknolojileri Japonya	15140-122
Plazmosin profilaktik	InvivoGen, San Diego, CA-ABD	karınca-mpp
Floresein stereomikroskop	BX8000, Keyence, Osaka Japonya	BZ-X710
Tam görünüm hücresi gözlem sistemi	Nikon, Kanagawa, Japonya	Biyostüdyo (BS-M10)
MKN45 insan mide kanseri hücre hattı	Riken, Tukuba Japonya	Yok

Serisi Serisi Serisi Serisi