Eksozom Blok Hazırlığı: Kültürlenmiş İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinden Eksozomları Korumak İçin Bir Protokol

Özet

Kaynak: Jung, M. K. et al. Transmisyon elektron mikroskobu ile eksozomların numune hazırlanması ve görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, kültürlenmiş gastrointestinal tümör hücrelerinden eksozom blokları hazırlama tekniği açıklanmaktadır. Bu eksozom blokları ayrıca lipid çift katmanlı veziküldeki spesifik proteinlerin konumunu belirlemek için dilimlenebilir, boyanabilir ve görüntülenebilir.

Protokol

1. Eksozomların Blok Hazırlığı

1. HCT116 hücrelerinin kültür süpernatantından eksozomları 1.5 saat boyunca 100.000 x g'da santrifüjleme yoluyla peletleyin. Kültür süpernatanını çıkarın ve saflaştırılmış eksozom peletini 1 mL %2.5 glutaraldehit ile 0.1 M sodyum kakodilat çözeltisi (pH 7.0) içinde 4 ° C'de 1 saat boyunca dikkatlice sabitleyin. 0.1 M sodyum kakodilat için, 4.28 g kakodilik asidi 160 mL damıtılmış suda (DW) çözün. PH'ı 0,1 M HCl ile 7,4'e ayarlayın, ardından damıtılmış su ile 200 mL'ye kadar hazırlayın.
2. Sabitleyiciyi çıkarın ve peletleri oda sıcaklığında 1 mL 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ile durulayın. Her değişiklik 10 dakika sürecek şekilde üç kez tekrarlayın.
3. Numuneyi 4 ° C'de 1 saat boyunca 1 mL% 2 osmiyum tetroksit ile sonradan sabitleyin.
4. Sabitleyiciyi çıkarın ve her 10 dakikada bir 0,1 M sodyum kakodilat tamponu ile üç kez durulayın.
5. Çalkalayıcı üzerinde kademeli bir aseton serisi (sırasıyla %50, %60, %70, %80, %90, %95, %100) ile 10 dakika inkübe edin.
6. Asetonu çıkarın ve 3: 1 aseton: düşük viskoziteli gömme karışımı çözeltisini 30 dakika boyunca inkübe edin. Eksozom peleti tüpün içindedir.
7. Ortamı çıkarın ve 1: 1 aseton: düşük viskoziteli gömme karışım ortamı ekleyin, ardından 30 dakika inkübe edin.
8. Ortamı çıkarın ve 1: 3 aseton: düşük viskoziteli gömme karışım ortamı ekleyin, ardından 30 dakika inkübe edin.
9. Ortamı çıkarın ve% 100 düşük viskoziteli gömme karışımı ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
10. Numuneyi, gömme kalıbını kullanarak saf düşük viskoziteli gömme karışımına gömün ve 65 ° C'de 24 saat pişirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gluteraldehit	EMS	16200
Sodyum kakodilat	EMS	12300
Osmiyum tetroksit 1 g kristal	EMS	19100	Sadece çeker ocakta kullanın
aseton	HAZİRAN	1B2031

Yılı Serisi