$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Kas Dondurma ve Montaj
- İzopentan içeren küçük bir plastik kabın (50 mL) alt yarısını sıvı nitrojene batırın. İzopentan, hafif viskoz hale geldiğinde ve beherin içini kaplayan katı beyaz bir laminat oluşturduğunda kullanıma hazırdır (sıcaklık: -160 °C).
not: Daima kıvılcım çıkarmayan bronz veya alüminyum el aletleri kullanın. Ürün buharını solumaktan kaçının. Yeterli havalandırma ile kullanın. Bir dökülme ve havalandırma ile uğraşmak imkansız veya pratik değilse, uygun bir solunum cihazı kullanın.
- Bir ayna (mantar) üzerindeki bazı gömme ortamlarını kısa bir süre (10 sn) izopentana batırarak dondurun.
- Liflerin oryantasyonunu korumak ve enine kesitlere izin vermek için kası (örneğin, tibialis veya gastroknemius), mantara göre dikey olarak tendondan tutarak tutun.
- Taze kasın uç kısmını dikkatlice donmuş gömme ortamının üzerine yerleştirin.
not: Kas yapışacak. Kasları gömme ortamı ile tamamen çevrelememek önemlidir. Kesit alanının daha sonra belirlenmesi için dikey yönlendirmenin korunması da önemlidir.
- Aynayı bağlı kas ile izopentan banyosuna batırın (numune boyutuna ve bileşimine bağlı olarak normal dondurma süresi 7-15 saniyedir).
not: Dondurma çözeltisine daldırma, numuneyi tamamen dondurmak için gerekenden daha uzun sürmemelidir. Çok uzun süre dondurmak doku bloğunu kırarken, çok kısa bir süre buz kristali oluşumuna neden olur. İyi donmuş bir örnek tebeşirimsi beyaz olacaktır.
- Numuneyi dondurduktan sonra küçük bir plastik torbaya veya numune tüpüne (50 mL) koyun ve hemen -80 °C'de derin dondurucuda veya sıvı nitrojen içinde saklayın.
2. Kas Kesiti
- Kriyostat iç haznesinin çalışma sıcaklığını yaklaşık -23 °C'ye ayarlayın.
- Numunenin (önceden -80 °C'de saklanan) çalışma sıcaklığında iklimlendirilmesine izin verin (birkaç saat yeterli olacaktır).
- Numunenin 8 μm kalınlığında birden fazla bölümünü (tercihen tibialis anterior veya gastroknemius kasları) kesin ve bunları cam slaytlarda toplayın.
not: Kasın orta göbek bölgesindeki bölümü kesin. Ayrıca, doğruluk adına, bölümleri montaj eksenine dik olarak kesin.
- Cam slaytları kriyostat odasının içinde tutun. Amaç IF/IHC çalışmaları veya enzimatik boyama yapmaksa çözülmelerine izin vermeyin.
- Daha fazla analiz için slaytları -80 °C'de saklayın.