$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Çözeltilerin Hazırlanması
- Tablo 1'de açıklandığı gibi, Kolon Tamponu, Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı %100, Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı %66, Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı %44, Kollajenaz E Sindirim Tamponu ve FACS Tamponunu hazırlayın.
- İşlemden bir gün önce Kolon Tamponu hazırlayın ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
- İşlemden bir gün önce %100 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı hazırlayın ve işlem sabahı çözülmesi için oda sıcaklığına koyarak gece boyunca 4 °C'de saklayın.
- İzolasyon sabahı oda sıcaklığında %100 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı ve Kolon Tamponu kullanarak %66 ve %44 Silika Bazlı Ayırma Ortamı hazırlayın.
- Uygun miktarda Clostridium histolyticum'dan türetilmiş Kollajenaz E'yi ölçün ve işlemden önce gece boyunca -20 ° C'de saklayın. Ertesi sabah, Kollajenaz Sindirim Tamponu elde etmek için uygun hacimde Kolon Tamponu içinde çözün. İşlem günü Kollajenaz Sindirim Tamponu ile yapılan tüm inkübasyonlar için, çözeltileri önceden 37 ° C'ye ısıtın.
- Protokol adımlarının tamamı için, gradyan santrifüjleme için frenler devre dışı bırakılmış (0 yavaşlama) ile bir santrifüjü 20 °C'de ve 859 x g dönüş hızında tutun. Yıkama adımları için standart yavaşlama ile 4 °C'ye ve 859 x g dönüş hızına ayarlayın.
2. Kolonun Hasat Edilmesi
- Fareyi CO2 boğulması ve ardından AALAC onaylı doğrulayıcı yöntemle ötenazi yapın.
- Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve kürkü %70 etanol püskürtün. Büyük doku makası kullanarak dikey bir orta hat kesisi yapın ve sağlam peritonu ortaya çıkarın.
- İnce diseksiyon makası kullanarak peritonu açın. İnce bağırsağı bir tarafa hareket ettirmek ve inen kolonu ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Kolonun rektal kısmını maksimum düzeyde ortaya çıkarmak için inen kolonu hafifçe yukarı doğru çekin. Distal rektumu pelvisin derinliklerinde kesin ve distal rektumdan çekal kapağına kadar tüm kolonu tek bir birim olarak diseksiyon ve çıkarın.
- Kolonu 50 mL'lik bir polipropilen tüpte 20 mL soğutulmuş Kolon Tamponu içinde aktarın.
3. Kolonun Temizlenmesi
- Kolonu nemli bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve makas veya forsepsin künt ucuyla bağırsak duvarına hafif bir baskı uygulayarak katı dışkıyı çıkarın.
- Kolonu bir Petri kabına yerleştirin ve 18G künt dolgu iğnesi ile 10 mL'lik bir şırınga kullanarak bağırsağı 10 mL soğutulmuş Kolon Tamponu ile yıkayın.
- Kolonu Kolon Tamponu nemli bir kağıt havluya aktarın ve makasın keskin ucuyla mezenter ve yağı çıkarın.
- Kolonu 5-10 mL soğutulmuş Kolon Tamponu ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin ve kalan kolon içeriğini yıkamak için manuel olarak çalkalayın. 2-3 kez tekrarlayın.
- Taze, soğutulmuş Kolon Tamponu ile doldurulmuş bir Petri kabında kolonu daha kaslı rektal ucundan proksimal kolona (tek bir dikdörtgen açık kolon parçası oluşturarak) uzunlamasına kesin. Mevcut ortamı atın ve temiz, soğutulmuş Kolon Tamponu ile yeniden doldurun.
- Bağırsağı Petri kabında kuvvetlice döndürerek ve her yıkamadan sonra 5-10 mL soğutulmuş Kolon Tamponunu değiştirerek 3 kez yıkayın.
- Dikdörtgen kolon dokusunu Kolon Tampon ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve yatay olarak dilimleyerek ve ardından küçük parçalar halinde (3 mm x 3 mm kesitler) kesin.
- Kolon parçalarını, 50 mL polipropilen konik tüpte 20 mL soğutulmuş Kolon Tamponuna ince forseps kullanarak dikkatlice toplayın.
- Kolon parçalarını üç kez yıkayın, her biri 20 mL Kolon Tamponunda yıkayın, tüpü 30 saniye boyunca kuvvetlice döndürerek. Her çalkalama arasında, doku parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Her yıkama arasındaki aspirasyon işleminde doku parçası kaybını önlerken süpernatanı boşaltın veya vakumla aspire edin.
not: Her yıkamadan sonra tüpü değiştirmeye gerek yoktur.
4. Kollajenaz Sindirimi 1
- 50 mL polipropilen konik tüpteki yıkanmış kolon parçalarına 20 mL Kollajenaz Sindirim Tamponu ekleyin.
- Kapalı 50 mL'lik tüpü 37 °C'de, dönüş hızı 60 dakika boyunca 2 x g olarak ayarlanmış inkübe edilmiş bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin. Ajitasyon sırasında doku parçalarının sürekli hareket halinde olduğundan emin olun; Gerekirse, hiçbir doku parçasının tüp tabanına yerleşmemesini sağlamak için dönüş hızını kademeli olarak artırın.
5. Silika Bazlı Ayırma Ortamı Degradelerini Hazırlayın
- 20 °C'de (oda sıcaklığı) %100 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı ve Kolon Tamponu kullanarak %66 ve %44 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı hazırlayın.
- 3 ayrı 15 mL polipropilen tüpün her birine 5 mL %66 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı dökün. Kolon başına üç tüp hazırlayın. Bu, ayırma gradyanını oluşturmak için üzerine daha düşük yoğunluklu ayırma ortamının katmanlanacağı gradyan izolasyon prosedürünün daha yüksek yoğunluklu tabanını oluşturur.
- Kullanana kadar 20 °C'de saklayın.
>6. Sindirimden Süpernatant Toplanması 1
- Kollajenaz Sindirimi 1 tamamlandıktan sonra, 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak sadece süpernatanı toplayın ve süpernatanı, temiz bir 50 mL polipropilen konik tüpe yerleştirilmiş 40 μm gözenekli bir filtrasyon kumaş hücre süzgecinden süzün. Mevcut doku parçalarını aspire etmemeye dikkat edin.
NOT: Tüpte kalan görünür doku parçalarını tutun. Bunlar ikinci kollajenaz sindirimine tabi tutulacaktır (aşama 8).
7. Söndürücü Kollajenaz Sindirim Tamponu
- 50 mL polipropilen tüpü tamamen soğutulmuş Kolon Tamponu ile doldurun.
not: Kollajenaz 37 °C'de aktiftir; bu nedenle soğutulmuş tampon bu enzimi inaktive eder.
- Tüpü 4 °C'de 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı vakum aspirasyonu ile atın. Hücreleri 25 mL taze Kolon Tamponu ile yıkayın ve 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Peleti 1 mL'den daha az taze, soğutulmuş Kolon Tamponunda yeniden süspanse edin.
- 50 mL polipropilen konik tüpü buzun üzerine yerleştirin.
8. Kollajenaz Sindirimi 2
- Adım 6.1'den kalan doku parçaları ile adım 4'ü (Sindirim 1) tekrarlayın.
9. Sindirimi Takiben Doku Ayrışması 2
- Doku parçalarını tüp ile 10 mL'lik bir şırınga arasında 18G künt uçlu bir iğne ile kuvvetlice ileri geri yıkayın.
- Bu yıkamayı en az 7-8 tam geçiş için tekrarlayın ve hiçbir brüt doku parçası veya kalıntı görünmeyene kadar devam edin.
10. Hücreleri Filtrele
- Doku ayrıştırma süspansiyonunu 40 μm gözenekli bir filtrasyon kumaş hücre süzgecinden temiz bir 50 mL polipropilen tüpe geçirin.
- Filtrede sıkışan hücreleri geri kazanmak için filtrasyon kumaş hücre süzgecini 10 mL soğutulmuş Kolon Tamponu ile yıkayın.
11. Kollajenaz Sindirimini Söndürme
- 50 mL polipropilen konik boruyu soğutulmuş Kolon Tamponu ile kenara kadar doldurun.
NOT: Kolon Tamponunun sıcaklığı, kollajenaz aktivitesinin söndürülmesini sağlamak için kritik öneme sahiptir.
- 4 °C'de ve 800 x g'da 5 dakika döndürün.
- Süpernatanı vakum aspirasyonu ile atın.
- 25 mL taze, soğutulmuş Kolon Tamponunda yeniden süspanse ederek yıkayın, ardından 4 ° C'de, 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı vakum aspirasyonu ile atın.
- Kollajenaz Sindirimi 1'den (adım 7) yeniden süspanse peleti adım 11.4'ten karşılık gelen tüpüne havuzlayın.
- Adım 11.4'ü tekrarlayın (yıkama ve santrifüjleme).
12. Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı Gradyan Ayrımı
NOT: Kollajenaz aktivitesinin hızlı bir şekilde söndürülmesini sağlamak için 12-13 arasındaki adımları mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin.
- Adım 11.7'yi takiben, her bir peleti kolon başına toplam 24 mL toplam %44 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamında yeniden süspanse edin.
- 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, adım 5.2'de hazırlanan üç tüpün her birine (% 66 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı içeren) adım 12.1'den 8 mL ortamı yavaşça katmanlayın. Arayüzün bozulmasını önlemek için gradyanı katmanlarken %44 Yoğunluk Ayırma Ortamının sabit ve yavaş akışını koruyun.
- Santrifüj kovalarındaki tüm tüpleri bir kantar veya terazi kullanarak dikkatli bir şekilde dengeleyin.
- Tüpleri 20 ° C'de frensiz bir santrifüjde 859 x g'da 20 dakika döndürün. Gradyan arayüzündeki hücreleri bozmamaya dikkat ederek, tüpleri çıkarmadan önce rotorların tamamen dinlenmesine izin verin.
13. Gradyan Arayüzünden Mononükleer Hücreleri Toplayın
- Tipik olarak 1-2 mm kalınlığında beyaz bir bandın (MNC içeren) bulunduğu gradyan arayüzünü (5 mL işaretinin yakınında) görselleştirin.
not: Biri beyaz bir bant görebilir veya görmeyebilir. Ancak, MNC bu arayüzde olacak ve gradyan arayüzünün netliğini bulanıklaştırmalıdır.
- Pipetin arayüze daha kolay erişmesini sağlamak için üst gradyanın üst 7 mL'sini vakumla aspire edin ve atın.
- Sürekli manuel emme ve sabit dönen bilek hareketi kullanarak, hücrelerin arayüz katmanını temiz bir 50 mL polipropilen konik tüpte toplayın. İki gradyan arasındaki arayüz berrak ve kırılabilir olana kadar (hücrelerden arındırılmış) toplayın.
- Toplama tüpünü 50 mL soğutulmuş FACS Tamponu ile doldurun. 4 °C'de, 800 x g'da 5 dakika döndürün.
- Süpernatanı vakum aspirasyonu ile aspire edin ve peleti 1 mL FACS Tamponunda yeniden süspanse edin.
- Uygun ölü hücre dışlama yöntemlerini kullanarak 1: 2 seyreltmede bir hemositometredeki hücreleri sayın.
- Yeni izole edilmiş kolonik MNC ile FACS boyamaya veya diğer tahlillere devam edin.
Tablo 1: Çözelti Hazırlama Tablosu
| çözüm | formül |
| Kolon Tamponu | 500 mL RPMI + 10mM HEPES +% 10 FBS (56° C'de60 dakika boyunca ısıyla inaktive edilir, pH 7.3'e ayarlanır) |
| Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortamı %100 (iki nokta üst üste başına) | 22,5 mL silika bazlı yoğunluk gradyan ortamı + 2,5 mL 10x PBS. |
| Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortamı %66 (iki nokta üst üste başına) | 10,72 mL Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortamı %100 + 5,28 mL Kolon Tamponu |
| Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortamı %44 (iki nokta üst üste başına) | 11 mL Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortamı %100 + 14 mL Kolon Tamponu |
| Kollajenaz Sindirim Tamponu (kolon başına) | Clostridium histolyticum'dan 100 U/mL Kollajenaz E, 40 mL Kolon Tamponu içinde çözülür |
| FACS Tamponu | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0.2 g Sodyum Azide |