İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İnsan Kaynaklı 3D Gastrik Fundik Organoidlerin Oluşturulması
NOT: Kontaminasyonu önlemek için, protokolü bütünüyle steril bir doku kültürü başlığı içinde gerçekleştirin. Sleeve gastrektomi (tüp mide) ameliyatı yapılan hastalardan insan fundik dokusu toplandı.
- Sleeve gastrektomi geçiren hastalardan dokuyu toplayın ve büyük bir plastik kap içinde buz gibi Ca2 + / Mg2 + içermeyen Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin'ine (DPBS) yerleştirin.
- Forseps kullanarak, dokuyu 100 mL Ca2 + / Mg2 + içermeyen DPBS içeren steril bir beherde kuvvetlice yıkayın. Yaklaşık 30 saniye boyunca veya kalıntı ve kan çıkana kadar yıkayın. Daha sonra, steril gazlı bez kullanarak, mukoza tabakasını epitelden silin.
- Büyük forseps kullanarak, dokunun kas tabakasını sıkıca kavrayın ve kuvvetle, büyük kavisli hemostatik forseps kullanarak epiteli kazıyın. Kazınmış epitel parçalarını steril, polistiren bir Petri kabına toplayın.
- Doku sindirimini optimize etmek için epitel dokusunu jilet kullanarak yaklaşık 2.0 x2.0 mm 2 boyutlu parçalar halinde doğrayın. Doku parçalarını antibiyotiklerle desteklenmiş Ca2 + / Mg2 + içermeyen DBPS (Ca2 + / Mg2 + içermeyen DPBS,% 1 Penisilin / Streptomisin, 0.25 mg / mL Amfoterisin B / 10 mg / mL Gentamisin, 50 mg / mL Kanamisin) ile yıkayın. Gerekirse birden fazla yıkama yapın. Yıkamayı steril bir gazlı bezden dikkatlice bir atık kabına süzerek yıkamayı atın.
- Yıkanmış parçaları, 25 mm'lik bir karıştırma çubuğu ve önceden ısıtılmış inkübasyon ortamı (2 mM L-glutamin,% 1 Penisilin / Streptomisin, 10 mM HEPES Tamponu ile desteklenmiş bazal ortam, 1 mg / mL Kollajenaz Tip 1, 2 mg / mL hücre kültürü dereceli Sığır Serum Albümini) ile 125 mL cam yuvarlak tabanlı bir şişeye toplayın. Yuvarlak tabanlı şişeyi kauçuk septa ile kapatın.
- Septaya 20 G'lik bir omurga iğnesi yerleştirin ve lastik hortumlu bir oksijen tankına bağlayın. Herhangi bir kirletici maddeyi filtrelemek için, bir filtre oluşturmak üzere boruya kağıt mendil yerleştirin. Oksijen çıkışını düşük seviyede açın. Septanın yırtılmasını önlemek için septaya 10-15 çıkış iğnesi yerleştirin.
- Kurulumu cl kullanarak bir halka standına sabitleyinamps ve 30-45 dakika boyunca bir karıştırma plakası ile 37 °C'ye kalibre edilmiş bir su banyosuna yerleştirin. Doku 15 dakika inkübe edildikten sonra, 50 μL inkübasyon ortamını çıkarın ve ayrışmış bezleri görsel olarak kontrol edin. Bezler yoğun değilse veya dokudan ayrılmamışsa, 5-10 dakika daha bırakın.
- İnkübasyondan hemen sonra, steril bir serolojik pipet kullanarak veya doğrudan inkübasyon karışımına dökerek inkübasyon ortamına 50 mL önceden ısıtılmış DMEM / F-12 ekleyin.
- Bez karışımını steril bir gazlı bezden dört adet 50 mL konik tüpe süzün. Ekstrakte edilen bezlerin konik tüpün dibine çökmesini sağlamak için süzüntüyü 15 dakika buz üzerinde tutun. Yerleşmiş bezleri rahatsız etmemeye dikkat edin; serolojik bir pipet kullanarak üstteki 40 mL süpernatanı çıkarın ve atın. Kalan 10 mL'yi antibiyotiklerle desteklenmiş 10 mL DPBS'de yeniden süspanse edin.
- Karışımı 5 mL hücre kültürü test tüplerine eşit olarak dağıtın. 4 ° C'de 65 x g'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipet kullanarak dikkatlice çıkarın.
not: Bu adımı buz üzerinde gerçekleştirmek ve karıştırma sırasında bazal membran matrisinin polimerizasyonunu önlemek çok önemlidir. Ek olarak, 50 μL'lik numune alarak bez yoğunluğunu görsel olarak incelemek önemlidir. Optimum yoğunluk ~%70 birleşmedir.
- Daha sonra, geniş uçlu bir pipet kullanarak bezleri bazal membran matrisinin 50 μL'sine yerleştirin. Kaplama sırasında herhangi bir kabarcık oluşturmaktan kaçının.
- Bazal membran matrisinin polimerize olmasına izin vermek için, 37 ° C'de 10 ila 15 dakika inkübe edin. 12 oyuklu bir kültür plakasında kaplama yapıyorsanız, 1 mL hFGO ortamı ekleyin (Gelişmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı / F-12 ortamı, 2mM L-glutamin,% 1 Penisilin / Streptomisin, 0.25 mg / mL Amfoterisin B / 10 mg / mL Gentamisin, 50 mg / mL Kanamisin, 10 mM HEPES Tamponu, 1 mM n-Akteilsistin, 1 x N2, 1 x B27, 100 ng/mL kemik morfogenetik protein inhibitörü, 1 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal Büyüme Faktörü, 200 ng/mL Fibroblast Büyüme Faktörü 10, 10 mM Nikotinamid ve 10 μM Y-27632 ROCK inhibitörü ile desteklenmiş %50 Wnt koşullu ortam, %20 R-spondin koşullu ortam) kuyu başına. 12 oyuklu bir kültür plakası kullanmıyorsanız, bazal membran matris kabarcığını daldırmak için yeterli ortam ekleyin.
- Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatöründe kültürleyin. Medyayı her 4-5 günde bir değiştirin.
