$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Enstrümanların, Kültür Ortamlarının ve Yemeklerin Hazırlanması
- Steril bir kapta bir set bağırsak makası, normal makas ve forseps otoklavlayın.
- 96 oyuklu (düz dipli) bir tabağı 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin.
- Malzeme Tablosunda listelenen reaktiflerle 10 mL tam kültür ortamı hazırlayın.
- Tüm ortamı 37 °C'de bir su banyosunda inkübe edin.
- Sulandırılmış bazal membranı bir buz kovasına yerleştirerek çözün. Sulandırılmış bazal membran 4 °C'de sıvı hale gelecektir.
- Dört Petri kabını soğuk fosfat tamponlu salin veya PBS (4 °C) ile doldurun.
2. İnce Bağırsak Kriptlerinin İzolasyonu
- C5BL6/J arka plan üzerinde bir Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 farenin CO 2 solunmasıyla fedakarlık. Peritonu bir makasla uzunlamasına inceleyin.
- Mideyi forseps ile tutun ve enlemesine ikiye bölün.
- Bundan sonra bağırsak makasını kullanarak bağırsağı dışarı çekin ve PBS.
içeren bir Petri kabına yerleştirin
not: Bağırsak makasının keskin ve keskin bir ucu vardır. Bu makasın kör ucu, bağırsağı açarken kript-villus mimarisine zarar vermemek içindir.
- Künt ucu mideye yerleştirerek başlayın ve nazikçe pilordan itin. Makasla keserek ve forseps ile çekerek ilerleyin.
- İnce bağırsağın tamamı uzunlamasına açıldıktan sonra forseps ile tutarak soğuk PBS'de yıkayın ve PBS solüsyonunda U şeklinde hareketlerle nazikçe durulayın.
- Tüm dışkı kalıntıları temizlendikten sonra, bağırsağı lümen tarafı yukarı bakacak şekilde bir kesme tahtası üzerinde düzleştirmeye devam edin. Luminal taraf, kan damarlarının olmaması ve dış kısım ile karşılaştırıldığında solgun görünümü ile kolayca tanınabilir.
- Bir cam slaytla, düzleştirilmiş bağırsağı kazıyarak villusları nazikçe çıkarın. Bu adımı dokunun tüm uzunluğu boyunca iki kez gerçekleştirin.
- İnce bağırsağı steril bir cerrahi bıçakla 2-5 mm'lik parçalar halinde kesin.
- İnce bağırsak parçalarını 10 mL buz gibi soğuk PBS içeren 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
- Doku parçalarını temizleyin, kalan kirleri PBS'de yukarı ve aşağı pipetleyerek çıkarın. Süpernatanı atın ve PBS tamamen temizlenene kadar bu adımı tekrarlayın.
- PBS'nin toplam nihai hacmini 25 mL'ye getirmek için 15 mL soğuk PBS ekleyin. 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 4 °C'de bir silindir üzerinde 45 dakika inkübe edin.
- PBS/EDTA'yı atın.
- 10 mL PBS ekleyin ve doku parçalarını sert bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyerek (en az üç kez) kriptleri ayırın. Süpernatanı topla.
- Adım 2.13'ü dört kez tekrarlayın. 50 mL'lik bir nihai hacme ulaşmak için kültür ortamı ekleyin.
- Hücreleri santrifüjleme ile pellet yapın (5 dakika boyunca 300 x g).
- Peletleri 10 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin ve kriptleri santrifüjleme ile peletleyin (3 dakika boyunca 80 x g).