Tavuk CAM'den Metastatik Kanser Hücresi Koloni İzolasyonu: Kabuksuz Yumurta Kültürlerinden Kanser Hücrelerini İzole Etme Prosedürü

Özet

Kaynak: Stoletov, K. et al. Hızlı ve Kantitatif İntravital Civciv Korioallantoik Membran Modeli Kullanılarak Metastatik Düzenleyicilerin Keşfi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, kabuksuz yumurta kültürü kullanılarak metastatik kanser hücresi kolonilerinin tavuk koryoallantoik zarından (CAM) izolasyonunu açıklıyoruz. Bu yöntem, kanser metastazından sorumlu olabilecek faktörlerin taranmasına yardımcı olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Metastatik Kolonilerin İzolasyonu

1. Enjeksiyondan sonraki 5. günde, embriyoları inkübatörden çıkarın ve embriyo CAM'lerini metastatik koloni dağılımı açısından inceleyin. Kompakt (veya aşırı invaziv) kolonilerin bulunduğu tek tip koloni dağılımına sahip embriyoları tanımlayın.
   not: Tavuk embriyolarının kültürlenme işlemi steril değildir, bu nedenle gelecekteki doku kültürü kontaminasyonunu önlemek için tüm tarama adımları son derece temiz koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Kontaminasyon oldukça nadirdir ve hücre enjeksiyonu ve koloni izolasyon prosedürleri sırasında eldiven ve maske takarak ve sadece steril aletler kullanarak kolayca önlenebilir. Ortam laboratuvar sıcaklığına maruz kalmalarını azaltmak ve kontaminasyonu önlemek için embriyoların tek tek incelenmesi önerilir.
2. İlgilenilen metastatik koloniyi bulun. Kompakt bir koloni, kanser hücrelerinin çoğunun CAM dokusunda sınırlı bir alanda bulunduğu bir koloni olarak tanımlanabilir (hücreler "birlikte kümelenmiş" görünür). İnvaziv bir koloni, kanser hücrelerinin CAM dokusunda "dağıldığı" bir koloni olarak tanımlanabilir (Şekil 1A, B).
   NOT: Metastatik koloninin "kompaktlığı", kanser hücresi istilasının inhibisyonu, kanser hücresi proliferasyonunun inhibisyonu veya her ikisi ile açıklanabilir. Tüm senaryolara dikkat edilmeli ve temas kolonileri izole edilmelidir (Şekil 1A, B). Kompakt ve invaziv metastatik koloni fenotiplerini ayırt etmek için basit bir floresan stereomikroskop kullanılabilir.
3. Diseksiyon mikroskobu altında, ilgilenilen metastatik koloniyi içeren CAM dokusunu ince forseps kullanarak nazikçe yukarı doğru çekin (Şekil 1C).
4. Metastatik koloniyi içeren CAM dokusunu cerrahi makas kullanarak kesin.
5. Metastatik koloniyi içeren CAM dokusunu boş, steril 1.5 mL'lik bir tüpe (buz üzerinde) aktarın ve tüp kapağını kapatın.
   not: İzole edilmiş koloniler, canlılık kaybı olmadan 3 saate kadar buz üzerinde tutulabilir.
6. İlgilenilen tüm koloniler ayrı tüplerde toplanana kadar eksizyon prosedürünü tekrarlayın. Hayvanların acı çekmesini önlemek için, bir embriyodan 2-3'ten fazla koloniyi çıkarmayın. Koloni eksizyonundan hemen sonra embriyoları -20 ° C'de (veya onaylanmış başka bir yöntemde) dondurarak ötenazi yapın.
7. Steril bir 18G iğne kullanarak CAM dokusunu bir mikrosantrifüj tüpünde nazikçe kıyın. Her koloni için ayrı bir iğne kullanın.
8. 100 μL 1x kollajenaz çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
9. Hücreleri ve CAM dokusunu ortam sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
10. Kollajenaz çözeltisini aspire edin ve hücreleri, ilgilenilen hücre hattı için kullanılan tam ortamda yeniden süspanse edin.
    not: Normalde, kollajenaz tedavisinden sonra CAM dokusu tamamen ayrışmaz ve kanser hücreleri önce CAM dokusu parçaları içinde çoğalır ve ancak daha sonra doku kültürü kabına göç eder.
11. Hücreleri ve CAM dokusunu ortam sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da tekrar döndürün.
12. Hücreleri ve CAM doku parçalarını 1 mL tam ortam artı seçim faktörü (varsa) içinde yeniden süspanse edin, ardından tek bir 12 oyuklu doku kültürü kabına aktarın.
    not: Tavuk CAM fibroblastları, klonal genişlemeyi inhibe eden çoklu geçişler için doku kültüründe kalabilir. Bir seçim faktörünün varlığında metastatik kolonileri genişletme yeteneği (yani, kanser hücrelerini floresan hale getirmek için kullanılan bir vektör aynı zamanda bir memeli antibiyotik direnç genini kodluyorsa) klonal genişlemeyi büyük ölçüde hızlandırabilir. Uygun antibiyotik konsantrasyonunun kullanıldığından emin olmak için taramadan önce bir öldürme eğrisi deneyi yapılmalıdır.
13. Önümüzdeki 1-3 hafta boyunca, kanser hücrelerini büyüme ve kontaminasyon açısından günlük olarak izleyin.
14. Hücreler birleşme oranının %70-80'ine ulaştığında, hücreleri daha büyük hacimli bir kültür kabına aktarın.
    not: Her klonun en az iki kriyojenik şişesi dondurulabilene kadar hücrelerin genişletilmesi önerilir. Büyük miktarlarda doku kültürünün sürdürülmesi zahmetli ve gereksiz olabilir.
15. Yeterli kanser hücresi sayısına ulaşılır ulaşılmaz dizilemeye veya bir sonraki seçim turuna geçin. Genel olarak, 1 x 10⁶ kanser hücresi, modern yüksek verimli dizileme teknikleri için yeterlidir.
16. Klon reenjeksiyonuna ve koloni kompaktlığının veya kanser hücresi-kan damarı temasının görüntülenmesine ve miktarının belirlenmesine devam edin (Şekil 2A). Alternatif olarak, yüksek verimli sıralamaya geçin veya koloni seçimini tekrarlayın.
    NOT: Yanlış pozitiflerin sayısını azaltmak için en az iki tur seçim önerilir. İki yaklaşım başarıyla uygulanmıştır. 1) Her klonu genişletin ve koloni fenotipini doğrulamak için ayrı ayrı yeniden enjekte edin. 2) Genişletilmiş tüm klonları her biri 1:1 oranında karıştırın, karışım olarak yeniden enjekte edin ve seçim döngüsünü tekrarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1. Tarama protokolünün farklı adımları için temsili sonuçlar.(A) Enjeksiyondan 5 gün sonra heterojen (kütüphane transdüksiyonlu kanser hücre hattı HEp3 hücreleri) tarafından oluşturulan metastatik koloniler. Kırmızı ok, eksize edilmesi gereken kompakt koloniyi (potansiyel pozitif vuruş) gösterir. (B) Enjeksiyondan 5 gün sonra, reenjeksiyondan sonra i...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL konik santrifüj tüpleri.	Corning	CLS430791-500EA
18 ölçü x 1 1/2 BD hassas iğne	Bd	BD305196	1,2 mm x 40 mm kullanıyoruz, mümkün Tercih edilirse daha kısa iğneler kullanmak
Tezgah üstü santrifüj.	Birçok kaynak mevcuttur		olan herhangi bir TC uyumlu santrifüj Hücreleri döndürmek için kullanılabilir is uygun
Kollajenaz	Sigma	C0130-100MG
pamuklu çubuklar	Birçok kaynak mevcuttur		Kullanmadan önce sterilize edilmelidir
Hücre için uygun kültür ortamı Kullanılan Hatlar	Birçok kaynak mevcuttur		HT1080, HEp3 ve b16 hücre yetiştiriyoruz DMEM'deki çizgiler, %10 FBS ortamı
Yumurta kuluçka makinesi	Birçok kaynak mevcuttur		Gerekli olan kesin bir model ekranın ölçeğine bağlıdır. Mevcut kaynaklar MGF Company Inc., Savannah, GA veya Lyon Electric Şirket A.Ş., Chula Vista, CA
EPPENDendor Tüpleri, 1.5ml	Sigma	T4816-250EA
Döllenmiş Beyaz Leghorn yumurtaları	herhangi bir yerel tedarikçi
İnce forseps	Birçok kaynak mevcuttur		kullanımdan önce sterilize edilmelidir
Görüntü analiz yazılımı			Nikon Elements'i kullanıyoruz
PBS (1 adet)	Birçok kaynak mevcuttur
Plastik ağırlıklandırma kapları	İthalat	CA11006-614	Boyutlar 78x78x25mm'dir; çok Diğer kaynaklar mevcuttur
küçük cerrahi makas	Birçok kaynak mevcuttur		Kullanmadan önce sterilize edilmelidir
Stereo floresan mikroskop			Zeiss Lumar v12 kullanıyoruz

Serisi Serisi