Murin Dil Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü: Dil Epitel Hücrelerini Fare Modelinden İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Özet

Kaynak: Prasad, M. et al. Adeno ilişkili bir virüs-Cas9 sistemi kullanılarak genetik olarak tasarlanmış bir murin baş ve boyun kanseri hücre hattının in vitro olarak kurulması. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, bir murin dilinden epitel hücrelerinin izolasyonunu anlatıyoruz. Bu hücreler, hücre kolonilerine yol açmak için daha fazla kültürlenebilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Birincil Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürü

1. 6 haftalık bir erkek veya kadın B6'ya ötenazi yapın; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J, CO₂ boğulması veya başka bir IACUC onaylı protokol ile.
   not: Bu CRISPR / Cas9 knockin fareleri, bir CAG promotörü tarafından yönlendirilen cas9 endonükleaz ve EGFP'nin Cre rekombinaza bağımlı ekspresyonuna sahiptir. Bu farelerin genomunda bulunan yukarı akış Lox-Stop-Lox (LSL) dizisi, Cre rekombinaz yokluğunda Cas9 ve EGFP'nin ekspresyonunu önler. Tek kılavuz RNA'lar (sgRNA'lar) ve bir Cre kaynağı ile birlikte kullanıldığında, tek veya çoklu fare genlerinin in vivo veya ex vivo olarak düzenlenmesine izin verirler.
2. Cerrahi makas kullanarak ötenazi yapılmış farelerden dili inceleyin.
3. Dil dokusunu bir neşter kullanarak çok küçük parçalara ayırarak dokuyu manuel olarak ayırın. Doku parçalarını 4.5 mL RPMI düz ortam (serumsuz) içeren 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
4. Üçlü enzim karışımını (200 μL) (tarif için Tablo 1'e bakınız) doku parçalarına ekleyin.
5. Doku-enzim karışımını 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve dokunun enzimatik ayrışmasını arttırmak için her 10 dakikada bir tüpe hafifçe vurun.
6. Enzim etkisini durdurmak için doku-enzim karışımına HBSS/PBS içeren% 5 fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
7. Dağılmış hücreleri ve daha büyük doku parçalarını ayırmak için yukarıdaki hücre süspansiyonunu steril bir 70 μm naylon ağdan süzün.
8. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu RT'de HBSS / PBS'de 5 dakika boyunca 300 x g santrifüjleme ile yıkayın.
9. Peleti kültür ortamında (RPMI/DMEM'de %10 FBS) yeniden süspanse edin ve farklı hücre kolonileri oluşana kadar 60 mm'lik kültür kaplarında büyütün.
   1. Kültür hücresi agregatları, hücre kolonileri oluşana kadar 3 mL tam ortam (RPMI/DMEM'de %10 FBS) içeren 60 mm'lik bir kültür kabında filtrenin üstünde tutulur.
10. 1 haftalık kültürden sonra primer hücreleri fibroblast kontaminasyonu varlığı açısından mikroskobik olarak inceleyin. Agregalardan ve hücre süspansiyonlarından geliştirilen birincil hücreleri, fibroblastları uzaklaştırmak için 37 ° C'de 1 dakika boyunca 0.25 tripsin% 0.02 EDTA çözeltisi ile muamele edin.
    not: Genellikle hücre agregatlarından elde edilen birincil kültür, tek hücreli süspansiyonlara kıyasla daha fazla koloni üretir. Bu kolonilerden alınan hücreler AAV iletimi ile daha iyi iletim verimliliği sağlar.

10X Üçlü Enzim Stok Çözeltisi:
Kollajenaz	1 g son konsantrasyon [10 mg / mL]
Hyaluronidaz	100 mg [1 mg / mL]
DNaz	20.000 Ünite son konsantrasyon [200 mg / mL]
PBS 1X	100 mL'ye kadar yapın

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan tampon tarifi

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fare suşları
C57BL/6	Envigo (Envigo)
B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)Fezh/J	Jackson laboratuvarları	24857
Nod. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)	Envigo (Envigo)
Enzim
Benzonaz	Sigma	E1014
Kollajenaz IV	Thermo Fisher Bilimsel	17104019
DNAse	Thermo Fisher Bilimsel	18047019
Hyaluronidaz	MilliporeSigma	H3506
Tripsin	Biyolojik Endüstriler İsrail BeitHaemek Ltd.	03-050-1B
Kültür Ortamları, Kimyasallar ve Reaktifler
Bsa	Amresco Belediyesi	0332-TAM-50G
DMEM (Ömer Çiçeğ	Biyolojik Endüstriler İsrail BeitHaemek Ltd.	01-055-1A
FBS (FBS)	Biyolojik Endüstriler İsrail BeitHaemek Ltd.	04-127-1A
HBSS (Türkçe)	Sigma	H6648
Pbs	Biyolojik Endüstriler İsrail BeitHaemek Ltd.	02-023-1A
Tris tamponu	MERCK Kırlangıç	648311-1KG
Plastik eşyalar
Amicon-ULTRA filtre 100 KDa	Kırlangıç	UFC910024
0,22 μm steril filtreler, 4 mm	Millex Tekstil	SLGV004SL
0,45 μm steril filtreler, 13 mm	Millex Tekstil	SLHV013SL
Kültür plakaları	Greiner Bio-Bir
Şahin tüpleri	Greiner Bio-Bir

Serisi Serisi Serisi Serisi