RNA CISH için FFPE Doku Ön Tedavisi: RNA Kromojenik In Situ Hibridizasyon için Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Doku Kesitlerini İşleme Prosedürü

Özet

Kaynak: Outh-Gauer, S. et al. HPV ile İlişkili Baş ve Boyun Kanseri Teşhisi için Bir Araç Olarak Kromojenik İn Situ Hibridizasyon. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, RNA kromojenik in situ hibridizasyon için FFPE doku örneklerinin ön işleminde yer alan adımları göstermektedir. Ön işlem süreci, hücreler içindeki nükleik asit bütünlüğünün ve genel doku morfolojisinin korunmasına yardımcı olur.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Malzemelerin Hazırlanması

1. 1x hedef alma reaktifinin hazırlanması
   1. Büyük bir beherde, 630 mL damıtılmış suya 70 mL 10x hedef alma reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
   2. Beheri manyetik karıştırıcılı bir ısıtma plakasına yerleştirin. Alüminyum folyo ile kaplayın.
   3. İçeriğini 100 °C'de 10–15 dakika kaynatın.
      NOT: 30 dakikadan fazla kaynatmayın.

2. Doku Ön İşlemi

>NOT: Bu adımlar, üreticinin baş ve boyun numuneleri için talimatlarına göre "standart" ön işlem önerisini takip eder. Bölüm 2.1 ve 2.2'nin zamanlamasının, manipüle edilen dokuya bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.

1. Peroksidaz aktivitesinin blokajı
   1. Her slayta 4-6 damla hidrojen peroksit ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   2. Slaytları oda sıcaklığında damıtılmış suda 2 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
2. RNA/doku bağlarının kırılması
   1. Bir pençe ile, bir ısıtma plakası üzerine yerleştirilmiş kaynayan 1x hedef alma reaktifinden (TTR1x) alüminyum folyoyu çıkarın ve karıştırmayı durdurun. Sürgülü rafı 15 dakika boyunca yavaşça ve çok dikkatli bir şekilde daldırın. Beheri tekrar alüminyum folyo ile örtün.
      not: Bu adımda kaynama devam etmelidir.
      Dikkat: Yanık yaralanmalarını önlemek için alüminyum folyoyu ve sürgülü rafı manipüle etmek için pençeyi kullanın. Eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun.
   2. Pençe ile sıcak sürgülü rafı hemen damıtılmış su banyosuna aktarın ve 2 dk.
      yıkayın not: Numunelerin TTR1x'te soğumadığından emin olun.
   3. Slaytları taze %100 etanolde 2 dakika yıkayın.
   4. Slaytları oda sıcaklığında 2 dakika kurumaya bırakın.
3. Bariyer oluşturma
   1. Hidrofobik bir bariyer kalemi ile (Malzeme Tablosuna bakın) numunenin etrafına bir bariyer çizin. En az 5 dk.
      kurumaya bırakın not: Bariyerin gerçekten kurumasına izin verin. İşlem sırasında yıpranırsa tekrar çizmekten çekinmeyin. Dokuya kalemle dokunmaktan kaçının. Protokol burada bir gecede duraklatılabilir.
4. Proteaz sindirimi
   1. Slaytları sürgülü rafa yerleştirin ve numune başına ~ 4 damla Protease Plus ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
   2. Nem kontrol tepsisini bir kapakla kapatın ve 40 °C'de 30 dakika boyunca hibridizasyon fırınına koyun.
      not: Buharlaşmayı önlemek için, çevirme düğmesinin tamamen kilit konumuna çevrildiğinden emin olun.
   3. Tepsiyi fırından çıkarın ve sürgülü rafı çıkarın.
   4. Her seferinde bir slayt, fazla sıvıyı hızlı bir şekilde çıkarın ve slaytı damıtılmış suyla doldurulmuş bir boyama kabına batırılmış bir sürgülü rafa yerleştirin.
   5. Slaytları oda sıcaklığında damıtılmış suda 2 dakika boyunca 2 kez yıkayın. Sürekli çalkalayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HybEZ Fırın (110v)	Gelişmiş Hücre Teşhisi A.Ş.	321710
HybEZ sürgülü raf	Gelişmiş Hücre Teşhisi A.Ş.	300104
ImmEdge Hidrofobik Bariyer Kalemi	Gelişmiş Hücre Teşhisi A.Ş.	310018
RNAscope H202 ve Proteaz Artı Reaktifi	Gelişmiş Hücre Teşhisi A.Ş.	322330	Hidrojen Peroksit x2 ve Proteaz Plus x 1
RNAscope Hedef Alma Reaktifleri	Gelişmiş Hücre Teşhisi A.Ş.	322000