1. Karşı Boyama Reaktiflerinin Hazırlanması
- % 50 hematoksilen hazırlayın.
- Bir davlumbazda, bir boyama kabındaki 100 mL damıtılmış suya 100 mL Gill's hematoksilen I (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
not: % 50 hematoksilen boyama solüsyonu 1 haftaya kadar tekrar kullanılabilir.
- % 0.02 (a / h) amonyak suyu (mavileştirme reaktifi) hazırlayın.
- Çeker ocakta, dereceli bir silindirde veya başka bir kapta 250 mL damıtılmış suya 1,43 mL 1 N amonyum hidroksit ekleyin. Silindiri parafin film ile kapatın. İçeriğini 3x–5x.
için iyice karıştırın
not: Tahlil kantitasyonu için amonyum hidroksit kullanmak çok önemlidir. Reaktifler önceden hazırlanabilir. Tüm kapların kapalı kaldığından emin olun.
2. 3,3'-diaminobenzidin ile Sinyal Algılama
DİKKAT: Diaminobenzidin (DAB) toksiktir. Bu kimyasalı atarken ve kullanırken uygun önlemleri ve güvenlik yönergelerini izleyin.
- Eşit hacimlerde DAB-A ve DAB-B'yi (Malzeme Tablosuna bakınız) uygun boyutta bir tüpte karıştırın ve her çözeltiden aynı sayıda damla dağıtın. Bölüm başına ~ 120 μL DAB substratı yapın (her reaktiften ~ 2 damla / toplam 4). 3x–5x için iyice karıştırın.
- Her bir slaytı teker teker sürgülü raftan alın ve sürgülü rafa yerleştirmeden önce fazla sıvıyı çıkarmak için dokunun ve/veya hafifçe vurun.
- Her doku bölümüne ~ 120 μL DAB pipetleyin. Bölümlerin kapalı olduğundan emin olun ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- Kalan DAB'ı yerel düzenlemelere göre atın ve sürgüyü musluk suyuyla dolu bir boyama kabına batırılmış bir sürgülü rafa yerleştirin.
3. Karşı boyama
- Sürgülü rafı %50 hematoksilen boyama solüsyonu içeren bir boyama kabına taşıyın, oda sıcaklığında 30 saniye dinlendirin. Slaytların mor olacağını unutmayın.
- Sürgülü rafı hemen musluk suyu içeren bir boyama kabına geri aktarın ve rafı yukarı ve aşağı hareket ettirerek slaytları 3x–5x yıkayın.
- Bölümler mor kalırken slaytlar berraklaşana kadar yıkama adımını taze musluk suyuyla tekrarlamaya devam edin.
- Boyama kabındaki musluk suyunu %0,02 amonyaklı su ile değiştirin. Rafı 2x–3x yukarı ve aşağı hareket ettirin. Doku bölümünün maviye dönmesi gerektiğini unutmayın.
- Amonyak suyunu musluk suyuyla değiştirin. Slaytları 3x–5x yıkayın.
4. Dehidrasyon
- Sürgülü rafı, çeker ocakta %70 etanol içeren bir boyama kabına taşıyın ve ara sıra çalkalayarak 2 dakika dinlendirin.
- Sürgülü rafı %100 etanol içeren bir ilk boyama kabına taşıyın ve ara sıra çalkalayarak 2 dakika dinlendirin.
- Sürgülü rafı %100 etanol içeren ikinci bir boyama kabına taşıyın ve ara sıra çalkalayarak 2 dakika dinlendirin.
- Sürgülü rafı ksilen içeren bir boyama kabına taşıyın ve ara sıra çalkalayarak 5 dakika dinlendirin.
5. Sürgülü Montaj
- Slaytları sürgülü raftan çıkarın ve çeker ocakta bölümler yukarı bakacak şekilde düz bir şekilde yerleştirin.
- Her kızağa 1 damla ksilen bazlı montaj ortamı ekleyerek ve bölümün üzerine dikkatlice 24 mm x 50 mm'lik bir lamel yerleştirerek her seferinde bir sürgü monte edin. Hava kabarcıklarını hapsetmekten kaçının.
- Slaytları ≥5 dakika havayla kurutun.
6. Örnek Değerlendirme
- Doku kesitlerini 20x–40x büyütmede standart bir parlak alan mikroskobu altında inceleyin.
