Sıçan Omurgasından DRG Toplama: Bir Sıçan Modelinin Omurgasından Dorsal Kök Ganglionunu Çıkarmak İçin Bir Prosedür

Bu makalede

Özet

Kaynak: Schmidt, L. B. et al. Baş ve Boyun Kanserinde Perinöral İnvazyonu Değerlendirmek için Civciv Korioallantoik Membran İn Vivo Model. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, aşağı akış uygulamaları için hasat edilmiş bir sıçan omurgasından dorsal kök ganglionunun veya DRG'nin ekstraksiyonunu gösteriyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. DRG'lerin Hasadı ve Hazırlanması (tahmini zamanlama: 2 saat, 8. gün)

NOT: Fareler ve sıçanlarla yapılan deneyler IACUC'den onay gerektirir. Bazı ülkelerde tavuk yumurtasının kullanımı da onay gerektirir.

DRG'leri çıkarmak için altı ila yedi haftalık Sprague Dawley sıçanları (~ 200 g ağırlıkta) alın.
not: Bir sıçan ~ 40 servikal ve torasik DRG vermelidir. Fare DRG ayrıca CAM'ye entegre olur; Bununla birlikte, bu türün koşullarının bağımsız olarak optimize edilmesi gerekir.
Bir laminer akış kabininde, başka bir yerde yayınlanan fare DRG ekstraksiyonu protokolünü izleyerek servikal ve torasik bölgelerden DRG'leri hasat edin. DRG'lerin nasıl hasat edileceğine ilişkin yönlendirme için Şekil 1'i takip edin.
1. İntraperitoneal olarak enjekte edilen Ketamin / Ksilazin uygulamasından sonra sıçanı kardiyak ponksiyon ile ötenazi yapın. Sıçan derisini %70 etanol ile temizleyin ve bir makas kullanarak sıçan omurgasını çıkarın. Servikal çıkık yapmayın çünkü bu servikal DRG'lere zarar verir.
2. Şekil 1A-D'de verilen şematik anatomik gösterimi ve brüt görüntüleri takip ederek servikal, torasik ve lomber bölgeleri aynı makasla ayırın. Dokuları ıslak tutmak için omurga bölümlerini 1X PBS ile 10 cm'lik bir kültür kabına yerleştirin.
3. Hassas bir kemik makası ile omurgayı iki yan yarıya ayırarak omurga kemiklerini dorsal ve ventral yönlerde açın (Şekil 1E-F). Doku bölümlerini taze 1X PBS ile 10 cm'lik temiz bir tabağa yerleştirin.
4. Forseps kullanarak, DRG'leri görselleştirmek için omuriliği omurilik kemiklerinden nazikçe ayırın (Şekil 1G).
5. Her DRG'nin altında tutulan ince forsepslerle kavrayın ve yerleştirildiği kemik boşluğundan dışarı çekin. DRG'yi doğrudan tutmayın çünkü bu doku hasarına neden olur. Akson demetlerini DRG'den kesmeyin (Şekil 1H).
  not: Lomber DRG'leri kullanmaktan kaçının çünkü bunlar CAM'a entegrasyonu azaltmıştır. DRG bölgesi konumu için Şekil 1A-D'deki şematik çizimi ve brüt anatomik görüntüleri takip edin.
Hasattan hemen sonra, DRG'lerin bakteriyel kontaminasyonunu önlemeye yardımcı olmak için her DRG'yi %2 Penisilin / Streptomisin (Pen / Strep) ve% 10 ısıyla inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM kültür ortamına yerleştirin. Tüm DRG'leri 4 mL kültür ortamı ile aynı 6 cm'lik kültür kabında gruplandırın.
Tüm DRG'leri hasat ettikten sonra, bunları %2 Pen/Strep artı %10 FBS ile desteklenmiş ve 1.25 μg/mL kırmızı floresan boya içeren DMEM kültür ortamı içeren yeni bir kültür kabına aktarın. Hücre kültürü inkübatöründe 1 saat inkübe edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1
Şekil 1: 8. günde DRG ekstraksiyonu. A. Omurganın anatomik konumunu gösteren sıçan şeması. B. Farklı vücut bölgelerini gösteren sıçan omurları konfigürasyonunun diyagramı; servikal için yeşil, torasik için koyu mavi, lomber için turuncu ve sakral vertebralar için açık mavidir. C-D. Cerrahi eksizyon sonrası sıçan omurgasının ventral yönü; <...