Civciv Korioallantoik Membran veya CAM Tümör Modeli: Tümör Hücrelerinin Perinöral İnvazyonunu Simüle Etmek İçin Bir In Ovo Yöntemi

Özet

Kaynak: Schmidt, L. B. et al. Baş ve Boyun Kanserinde Perinöral İnvazyonu Değerlendirmek için Civciv Korioallantoik Membran İn Vivo Model. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, perinöral invazyonu incelemek için civciv koryoallantoik membran veya CAM üzerinde dorsal kök gangliyonları ve kanser hücrelerini birlikte kültürleme yöntemini açıklıyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. DRG'nin CAM'de aşılanması (tahmini zamanlama: 40 dakika, 8. gün)

1. İmplantasyondan önce DRG'leri yıkamak için HBSS besiyeri ile 6 cm'lik bir kültür kabı hazırlayın. Hazırlanan yumurtaları hücre kültürü laminer akış kabinine getirin. Parafin zarını yumurtadan çıkarın (Şekil 1A).
2. İnce steril forsepslerle, bir DRG'yi kültür ortamının içinden nazikçe kavrayın. Floresan boyayı içeren fazla ortamı çıkarmak için HBSS ortamına batırın. DRG'yi çok nazikçe tutun; Aksi takdirde forsepslere yapışacaktır.
3. Membranı delmemeye dikkat ederek DRG'yi CAM'ın üzerine yerleştirin (Şekil 1B-C). Gerekirse, DRG'yi CAM'a yerleştirirken forsepsin ucundan ayırmaya yardımcı olması için başka bir forseps çifti kullanın.
   not: DRG'yi HBSS besiyeri ile ıslak tutmak da forsepsten ayrılmayı kolaylaştıracaktır.
4. Yumurtayı steril şeffaf bir film sargı ile örtün. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için yumurta kabuğunda yapılan tüm pencereleri ve delikleri kapatın (Şekil 1D).
5. DRG'leri tüm yumurtalara aşıladıktan sonra, yumurtaları 38 °C'de ve% 54 nemde nemlendirici bir inkübatörde 2 gün boyunca döndürmeden kuluçkaya yatırın.

2. Tümör Hücrelerinin CAM'de Greftlenmesi (tahmini zamanlama: 1 saat 30 dakika, 10. gün)

1. Hücreleri aşılamadan 48 saat önce, kültür plakalarında ihtiyaç duyulan hücreleri plakalayın. CAM'de üç boyutlu tümörler oluşturmak için UM-SCC-1 hücreleri için yumurta başına 0,5 ila 1 x 10⁶ hücre hesaplayın. Hücre numarasının hücre hattına göre değişebileceğini unutmayın.
2. Besiyerini aspire edin ve %1 Pen/Strep artı %10 FBS ve 2,5 μg/mL yeşil floresan boya ile takviye edilmiş DMEM kültür ortamı ekleyin. Hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Ardından, mikroskopta floresan yoğunluğunu kontrol edin, ortamı aspire edin, 1X PBS ile bir kez yıkayın ve 10 dakikaya kadar% 0.25 tripsin ekleyin. Tripsini DMEM takviyeli ortam ile nötralize edin.
3. Bir hücre peleti oluşturmak için 250 x g'da 4 dakika santrifüjleyin. DMEM ortamını aspire edin ve fazla floresan boyayı yıkamak için HBSS'de yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
4. Yumurtaları hücre kültürü laminer akış kabinine getirin. Makas ve forseps ile yumurtanın üzerini örten şeffaf film sargıyı açın (Şekil 1E-F).
5. Hesaplanan hücre sayısını tekrar santrifüjleyin, HBSS ortamını aspire edin ve aynı ortamın 5 μL'si başına 0.5 ila 1 x 10⁶ hücrelik bir nihai konsantrasyonda yeniden süspanse edin (Şekil 1G). Toplam yumurta sayısı için gereken miktarı hazırlayın (yumurta başına 5 μL hücre süspansiyonu).
6. 5 μL hücre solüsyonunu DRG'den yaklaşık 2 mm uzakta olacak şekilde CAM üzerine yerleştirin (Şekil 1H). DRG ve hücreler arasında eşit mesafeler bırakın. Hücrelerin yayılmasını en aza indirmek için yumurtayı rahatsız etmemeye çok dikkat edin.
   not: Hücre implantasyonunu başlatmak için, CAM yüzeyinin görsel olarak kuru olduğu yumurtaları seçin. Yüzey çok ıslaksa, hücreler yayılabilir ve düzenli tümörler oluşturmaz.
7. Yumurtayı adım 1.4'teki gibi yeni bir film pansuman ile örtün. Hücreleri tüm yumurtalara aşılayın. Yumurtaları nemlendirme inkübatörde 38 °C ve% 54 nemde 7 gün boyunca döndürmeden kuluçkaya yatırın.

Sonuçlar

Şekil 1: DRG'nin, hücrelerin aşılanması ve CAM'ın toplanması: 8. günde: A. CAM, parafin mumu zarının çıkarılmasından sonra kolayca gözlenir. M.Ö. İnce forsepslerle DRG, CAM üzerine yerleştirilir. Yumurta film pansuman ile kaplanır ve kuluçka makinesine konur; Oklar, kapatılan açıklıkları gösterir. 10. günde: E-F. Film sarg...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yumurta kuluçka makinesi	GQF Dijital Sporcu	#1502	Otomatik döndürücü dijital termostat sıcaklık ve nem kontrolleri ile donatılmış yumurta kuluçka makinesi
Gravür kesici	DREMEL (DREMEL	#108	Yumurta kabuğunu delmek için kullanılır
Ekstra ince Graefe forseps, kavisli	Güzel Bilim Araçları (FST)	# 11151-10	8. günde DRG'yi CAM'a aşılamak ve 17. günde CAM dokusunu hasat etmek için kullanılır
Ekstra ince Graefe forseps, düz	Güzel Bilim Araçları (FST)	# 11150-10	8. günde DRG'yi CAM'a aşılamak ve 17. günde CAM dokusunu hasat etmek için kullanılır
Döllenmiş Lohmann Beyaz Leghorn yumurtaları			Erken döllenme günlerinde, tercihen döllenmeden sonraki ilk gün döllenmiş yumurtalar. Bu protokolde kullanılan yumurtalar Michigan Eyalet Üniversitesi Tavuk Çiftliği'ndendir.
Filtre Forseps	EMD Kırlangıç	#XX6200006P	Yumurta kabuğunu çıkarmak için kullanılan künt forseps
HBSS (1 adet)	Gibco (Gibco)	#14025-092	Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi
Parafin balmumu zarı	Parafilm laboratuvar filmi	#PM-996	8. günde DRG aşılamasına kadar yumurta açıklıklarını geçici olarak kapatmak için kullanılır.
PBS (1x) pH 7.4	Gibco (Gibco)	#10010-023	Fosfat Tamponlu Tuzlu
Tegaderm Şeffaf Film Örtü	3 milyon	#9505W	Steril, 6x7 cm, kuluçka sırasında yumurta açıklıklarını kapatmak için kullanılır

Türkçesi) Su