Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hücrelerin Yan Inokülasyonu ve İntratümöral antagomiR Tedavisi
- Hücre hazırlığı
- GFP ve lusiferazı (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP) yapısal olarak eksprese eden transgenik bir yapıyı aşırı eksprese etmek için bir Cal62 insan tiroid kanseri hücre hattı (KRASG12R ve p53A161D mutasyonları) tasarlayın. Transgenik hücreleri antibiyotik direncine göre veya GFP pozitif hücreleri akış sitometrisi ile sıralayarak seçin.
- Hücreleri, 37 ° C ve% 5 CO2'de penisilin, streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamındaki (DMEM) büyütün.
- 4 ° C'de 50 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 x 106 hücreyi askıya alın.
- Farelerin yanlarına hücre aşılaması
- Hücreleri aynı miktarda bazal membran matrisi ile karıştırın. Örneğin, 50 μL PBS'de 1 x 106 hücreyi 50 μL bazal membran matrisine ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve hafifçe karıştırın.
- 100 μL numuneyi (PBS + bazal membran matrisindeki hücreler) 27G 1/2 '' (0.4x13 mm) iğne ile 1 mL insülin şırıngası kullanarak 6 haftalık immün yetmezliği olan BALB/c nu/nu farelerinin sol kanadına deri altından enjekte edin.
- İntratümöral antagomiR tedavisi
- 500 μL RNaz içermeyen damıtılmış suda antagomiR'yi (Malzeme Tablosuna bakınız) veya negatif kontrolü askıya alın.
- Enjeksiyondan önce, her enjeksiyon için 2 nmol antagomiR veya kontrolü bir in vivo dağıtım reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) ile birlikte hazırlayın.
- İlk olarak, antagomiR çözeltisini (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kompleksleşme tamponunu (Malzeme Tablosuna bakınız) 1:1 oranında karıştırın. Örneğin, 80 μL kompleksleşme tamponuna 80 μL miRNA inhibitör çözeltisi (16 nmol) ekleyin (in vivo dağıtım reaktif kitine dahildir, Malzeme Tablosuna bakınız).
- İn vivo dağıtım reaktifini oda sıcaklığına getirin. 1.5 mL'lik bir tüpe 160 μL ekleyin ve hemen 160 μL seyreltilmiş antagomiR çözeltisi ekleyin. Kalan reaktifi -20 °C'ye geri koyun. Gerekirse, reaktifi çözüldükten sonra bir haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
- İn vivo dağıtım reaktifi-antagomiR'nin kompleksleşmesini sağlamak için hemen (10 s) vorteks yapın.
- İn vivo dağıtım reaktifi-antagomiR karışımını 50 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Numuneyi geri kazanmak için tüpü kısa bir süre santrifüjleyin.
- 1360 μL PBS pH 7.4 ekleyerek kompleksi 6 kat seyreltin ve iyice karıştırın.
- Reaktif-antagomiR kompleksinin (8 fare / durum) in vivo uygulamasına devam edin veya kompleksi enjeksiyondan önce bir haftaya kadar 4 ° C'de saklayın. Her tümöre intratümöral olarak 200 μL enjekte edin (2 nmol antagomiR).
NOT: AntagomiR'nin hacmi ve miktarı tümör hacminden bağımsızdır.
- Tedaviyi 2 hafta boyunca haftada 3 kez (Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) uygulayın.
- Tümör büyümesinin analizi
- 27G 1/2 '' (0.4 mm x 13 mm) iğne ile 1 mL'lik bir şırınga ile her zaman noktasında 40 mg / mL'lik bir D-lusiferin substrat çözeltisinin 50 μL'sini (Malzeme Tablosuna bakınız) deri altına enjekte edin.
- Enjeksiyondan 8 dakika sonra, oksijenle karıştırılmış% 3 izofluran kullanarak fareleri uyuşturun. Anestezi seviyesini pedal refleksi (sert ayak parmağı çimdikleme) ile değerlendirin ve cerrahi düzlemi korumak için anestezik uygulamayı uygun şekilde ayarlayın.
- Kurumayı önlemek için her iki göze de oftalmik merhem sürün.
- Biyolüminesan sinyali in vivo görüntüleme yazılımı ile görüntüleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Kaliperler, tümör hacmini ve tümör büyümesini ölçmek için de kullanılabilir.
- Biyolüminesans sinyalleri elde edildikten sonra, her iki tedaviyi karşılaştırarak tümöral büyümeyi analiz edin ve bir t-testi kullanarak önemini belirleyin. Grup içi varyansı analiz etmek için SEM'i kullanın.
