3D sferoidlerin agaroz jel damlalarına gömülmesi: Aşağı akış analizi için sferoidleri korumak için bir teknik

Özet

Kaynak: Rolver, M. G. et al. Kanser Hücrelerinin 3B Küresel Kültürlerinde Hücre Canlılığının ve Ölümünün Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, koruma amacıyla agaroz jel damlalarına 3D sferoidleri yerleştirme tekniği açıklanmaktadır. Gömülü 3D sferoidler, aşağı akış analizi için daha fazla kullanılabilir.

Protokol

1. 3D Sferoidlerin Gömülmesi

1. Sferoidlerin gömülü olduğu agaroz jeli hazırlayın (sadece protokolü ilk kez gerçekleştirmek için gereklidir)
   1. 1 g bacto-agar'ı 50 mL ddH₂O içinde karıştırın.
   2. Pastırma-agar eriyene ve homojen bir jel oluşana kadar mikrodalga fırında yavaşça ısıtın. Jelin kaynamasına izin vermeyin.
   3. Bacto-agar'ı 60 °C'lik bir su banyosunda sıcak tutun.
   4. Deneyler arasında 4 °C'de tutun.
2. Sferoidlerin gömülmesi
   1. 1. günde, her koşul için 1,5 mL'lik bir tüpte en az 12 sferoid toplayın.
   2. 1 mL buz gibi soğuk 1X PBS ile bir kez yıkayın.
   3. Sferoidleri sabitlemek için 1 mL %4 paraformaldehit ekleyin.
      not: Paraformaldehitin taşınması bir davlumbazda yapılmalıdır.
   4. RT'de 24 saat kuluçkaya yatmalarına izin verin.
   5. 2. günde, agaroz jeli bir mikrodalga fırında su dolu bir behere koyarak dikkatlice ısıtın. Jelin kaynamadığından emin olun. Kullanana kadar 60 °C'de tezgah üstü ısıtma plakasında sıcak tutun.
   6. Sferoidleri 1 mL buz gibi soğuk 1X PBS ile iki kez yıkayın.
   7. 1X PBS'nin çoğunu aspire edin (bu noktada yaklaşık 100 μL bırakmak, sferoidleri işlemek için pratiktir).
   8. Daha büyük delikli daha sivri bir uç elde etmek için pipet ucunu eğimli bir şekilde keserek 20 μL'lik bir pipet hazırlayın (Şekil 1).
      NOT: Optimum sferoid transferini sağlamak ve jel damlasının katılaşmasını önlemek için bir sonraki kısım hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Isıtma bloğu yoksa, önce sferoidleri yakalamanız ve ardından agarozun düşmesini sağlamanız önerilir (yani, 1.2.9 ve 1.2.10 noktalarının sırasını değiştirmek).
   9. Mikroskop lamı üzerine bir agaroz jel damlası yapın. Agarozun katılaşmasını önlemek için sürgüyü ılık bir ısıtma bloğuna yerleştirin.
   10. Modifiye edilmiş pipet ucunu (adım 1.2.8) kullanarak, 15-20 μL'lik bir hacimde mümkün olduğunca çok sayıda sferoid yakalayın.
   11. 15–20 μL küresel içeren 1X PBS'yi mikroskop lamına dokunmadan agaroz jel damlasının ortasına dikkatlice enjekte edin.
       not: Bu biraz zor bir nokta. Sferoidler jel damlasına enjekte edilirken pipet ucu mikroskop lamına temas ederse sferoidler kaybolacaktır. Agarozun damla haline getirilmesi ve damlanın içine renkli bir sıvı enjekte edilerek sferoidlerin enjekte edilmesi işleminin tamamının uygulanması tavsiye edilir. Bu, renkli sıvı lam üzerine sızacağı için damla boyunca potansiyel bir penetrasyonun görselleştirilmesine izin verecektir.
   12. Agaroz jelin RT'de veya 4 °C'de 5-10 dakika inkübe ederek sertleşmesine izin verin. Jel damlası biraz katılaştığında (ancak yine de oldukça yumuşak olduğunda), jel damlasını mikroskop lamından bir neşter ile plastik bir doku kasetine dikkatlice itin.
   13. Plastik doku kasetlerini %70 etanol ile kaplayın.
       not: Bu noktada, sferoidler doğrudan kullanılabilir veya aylarca saklanabilir.
   14. Agaroz gömülü sferoidi parafine gömün, 2-3 μm kalınlığında tabaka slaytlarına bölün ve hematoksilen ve eozin ile boyayın veya immüno-histolojik boyamaya tabi tutun.

Sonuçlar

Şekil 1: Sferoidlerin fiksasyonu, gömülmesi ve immünohistokimya analizi. (A) Sferoidlerin gömülmesi için protokolün şematik gösterimi. Bireysel adımlar (i-vii) olarak işaretlenmiştir. (B) Gömülü MDA-MB-231 küresinin görüntüsü. Ölçek çubuğu: 50 μm. (C) P-53'e karşı antikorlarla IHC analizine tabi tutulan kemoterapi ile teda...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bactoagar Belediyesi	BD Biyobilim	#214010	Agaroz jel hazırlama için kullanılır
Formaldehit	VWR Kimyasalları	#9713.1000	Hücre fiksasyonu için kullanılır
Medim Uni-güvenli kaset	Medim Histotechnologie	10-0114	Gömülü sferoidlerin depolanması için kullanılır
Superfrost Ultra-Plus Yapışma kaydırağı	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	Gömme için kullanılan mikroskop cam slayt
CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılık Testi	Promega	#G9681	Hücre canlılığı testi için kullanılır

Fuar