$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Dil Hücre Dışı Matriksin (TEM) Hazırlanması
- Fareleri servikal çıkık ile uygulayın ve steril cerrahi makas ve cımbız kullanarak dilleri çıkarın.
- Dilleri 3 dakika boyunca% 75 etanole batırın, ardından her dili 1 mL 10 mM steril fosfat tamponlu çözelti (PBS) içeren 1,5 mL Eppendorf (EP) tüpüne koyun.
not: Aşağıdaki tüm adımlardaki PBS konsantrasyonu, bu adımdaki konsantrasyon ile aynıdır.
- Donma-çözme ile hücre parçalanması: Dilleri EP tüplerinde -80 °C'de 1 saat dondurun ve ardından dilleri oda sıcaklığında 45 dakika 3 döngü boyunca çözdürün.
- Her dili bir cerrahi iğne kullanarak bir cerrahi dikiş parçasına yükleyin ve dikişin ucunu küçük bir steril teneke parçasıyla sarın. İşlemi steril koşullarda %75 etanol içeren 3,5 cm veya 6 cm'lik bir kültür kabında gerçekleştirin.
not: Her bir cerrahi dikiş parçasının uygun uzunluğu yaklaşık 20 cm'dir ve her bir folyo parçasının uygun boyutu yaklaşık 0,3cm2'dir (1 cm x 0,3 cm). Dil, teneke yakınına yüklenmelidir.
- Her dili 3,5 cm veya 6 cm'lik bir kültür kabında 3 mL steril PBS ile 30 saniye durulayın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirin.
- Dilleri ultra saf suyla yıkayın: 250 mL steril ultra saf su içeren geniş ağızlı bir şişeye 90 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar ampisilin ekleyin. Dilleri bir karıştırma çubuğu içeren şişeye koyun. Sütürün bir kısmı şişenin dışında kalacak şekilde şişe kapağını sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirin.
not: Sütürün kıvrılması göz önünde bulundurularak aynı şişeye en fazla 5 dil konulabilir. Teneke folyo, dilin kaymasını önlemek için şişedeki dikişin ucundadır. Diller şişenin dibinden 2 cm yüksekliğe, biberon içinde kalan dikişin uzunluğu ayarlanarak yerleştirilmelidir. Bu not aynı zamanda 1.8, 1.10, 1.12 ve 1.16 adımları için de geçerlidir.
- Şişeyi 12 saat boyunca manyetik bir karıştırıcıya koyun.
- Dilleri NaCl ile yıkayın: 250 mL steril 1 M NaCl içeren geniş ağızlı bir şişeye 90 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar ampisilin ekleyin. Dilleri ve karıştırma çubuğunu şişeye taşıyın. Sütürün bir kısmı şişenin dışında kalacak şekilde şişe kapağını sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirin.
- Şişeyi 24 saat boyunca manyetik bir karıştırıcıya koyun.
- Triton X-100 ile hücre lizisi: PBS'de 250 mL steril% 2 Triton X-100 içeren geniş ağızlı bir şişeye 90 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ampisilin ekleyin. Dilleri ve karıştırma çubuğunu şişeye taşıyın. Sütürün bir kısmı şişenin dışında kalacak şekilde şişe kapağını sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirin.
- Şişeyi 48 saat boyunca manyetik bir karıştırıcıya koyun.
- Dilleri CaCl2 / MgCl2 ile yıkayın: 250 mL steril 5 mM CaCl2 / MgCl2 ile 90 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar geniş ağızlı bir şişeye ampisilin ekleyin. Dilleri ve karıştırma çubuğunu şişeye taşıyın. Sütürün bir kısmı şişenin dışında kalacak şekilde şişe kapağını sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirin.
- Şişeyi 24 saat boyunca manyetik bir karıştırıcıya koyun.
- DNaz ile Sindirim: Her EP tüpüne 1 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ekleyin. DNaz'ı sırasıyla HBSS'ye 300 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Her dili, sütürün bir kısmı tüpün dışında olacak şekilde her bir EP tüpüne taşıyın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirin.
not: Önceki adımlarda sütürün şişelerin içinde kalan kısmının bu adımda da EP tüpünün içinde kaldığından emin olun ve önceki adımlarda sütürün şişelerin dışında kalan kısmının bu adımda da EP tüpünün dışında kaldığından emin olun.
- Dilleri EP tüplerinde 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
- Dilleri PBS ile yıkayın: 250 mL steril PBS içeren geniş ağızlı bir şişeye 90 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar ampisilin ekleyin. Dilleri ve karıştırma çubuğunu şişeye taşıyın. Sütürün bir kısmı şişenin dışında kalacak şekilde şişe kapağını sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirin.
- Şişeyi 24 saat boyunca manyetik bir karıştırıcıya koyun.
- Hazırlanan TEM'i kullanana kadar steril PBS'de 4 °C'de saklayın.