Hücreden Arındırılmış Dokunun Kriyofrezelemesi: İnce Hücre Dışı Matriks Tozu Elde Etmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Kornmuller, A. et al. Dokuya Özgü Hücre Kültürü ve Dağıtım Platformları Olarak Hücre Dışı Matriks Türetilmiş Köpüklerin ve Mikro Taşıyıcıların İmalatı. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, kriyofrezeleme ile liyofilize hücreden arındırılmış dokudan ince öğütülmüş hücre dışı matris tozu elde etmek için protokolü sunuyoruz. Toz haline getirilmiş ECM, biyokimyasal bileşimini korur ve mikro taşıyıcı sentezi için kullanılabilir.

Protokol

1. Hücreden Arındırılmış Doku İşleme

1. Dehücreselleşme ve Liyofilizasyon
   1. Yerleşik bir protokolü izleyerek ilgilenilen dokuları hücreden arındırın.
      not: Mevcut çalışmadaki iskeleler, insan DAT, domuz DDT ve domuz DLV'si için yayınlanmış hücre çözme protokollerine göre hazırlanmıştır. Ticari olarak temin edilebilen, çözünmeyen kolajen, 10-50 mg / mL'lik bir konsantrasyon aralığında başarıyla kullanılan sığır tendonundan elde edilen kolajen gibi köpükleri ve mikro taşıyıcıları üretmek için de kullanılabilir. Diğer çözünmeyen kollajen kaynakları kullanılabilir, ancak stabil iskeleler oluşturacak konsantrasyon aralığını belirlemek için optimizasyon gerekebilir.
   2. Hidratlanmış hücrelerden arındırılmış dokuyu veya saflaştırılmış kollajeni forsepsli 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve dokuyu maksimum toplam 35 mL hacme daldırmak için yeterli çift damıtılmış su (ddH₂O) ekleyin.
   3. Numuneyi gece boyunca -80 °C'de dondurun, sonraki liyofilizasyon sırasında süblimasyon için yüzey alanını en üst düzeye çıkarmak için santrifüj tüpü dondurma sırasında yatay olarak konumlandırılmıştır.
   4. Santrifüj tüpünün kapağını çıkarın ve donmuş numuneyi bir liyofilizasyon kavanozuna aktarın.
   5. Numuneyi bir laboratuvar dondurarak kurutucu kullanarak 48-72 saat veya tamamen kuruyana kadar liyofilize edin.
      not: Kuruma süresi, farklı liyofilizatörler ve decellularized dokular için değişebilir.
   6. Liyofilize ECM'yi keskin cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde (~ 1–2 mm³) ince bir şekilde kıyın.
   7. Kıyılmış ECM'yi daha sonraki işlemlere hazır olana kadar bir kurutucuda saklayın.
      not: Ortamdan nem emilimini önlemek için kıyılmış ECM'nin hemen kullanılması tavsiye edilir.
2. Kriyofrezeleme (köpük üretimi için isteğe bağlı)
   1. Kıyılmış liyofilize ECM ile bir laboratuvar bilyalı değirmen sistemi için 25 mL'lik bir paslanmaz çelik freze haznesini doldurun ve iki adet 10 mm paslanmaz çelik freze bilyesi ekleyin.
   2. Yüklü freze haznesini kapatın ve 3 dakika boyunca sıvı nitrojene tamamen daldırın.
   3. Dondurulmuş numuneyi 3 Hz'de (30 rpm) 1,800 dakika öğütün.
   4. ECM ince bir toz haline gelene kadar 1.2.2 ve 1.2.3 adımlarını tekrarlayın.
      not: Bu adımların tekrarlanması gereken sayı ECM kaynakları arasında farklılık gösterebilir. Örneğin, DAT tipik olarak ince bir toz oluşturmak için 3 öğütme döngüsü gerektirir.
   5. Tozu bir kepçe kullanarak bir cam şişeye aktarın, sıkıca kapatın ve bir desikatörde saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Timsah klipsi uçları	VWR (VWR)	470149-728
Alüminyum folyo	Balıkçı Bilimsel	01-213-101
Analitik terazi	Sartorius	CPA225D
Kriyofrezeleme sistemi	Retsch	20.745.0001	MM 400 Serisi
Kurutucu	Balıkçı Bilimsel	8624426	Liyofilize ECM ve biyoiskele depolaması için
Dewar şişesi	Balıkçı Bilimsel	10-196-6	Düşük form; 250 - 500 mL hacim aralığı
Çift damıtılmış su (ddH2O)			Barnstead GenPure xCAD Su Arıtma Sisteminden
ECM (Hücre Dışı Matris)			Flynn ve ark. 2010, Reing ve ark. 2010 ve Wainwright ve ark. 2010'da tarif edildiği gibi insan yağ dokusu, domuz dermisi veya domuz miyokardından izole
Forseps	VWR (VWR)	37-501-32	Köpükleri aktarmak için
Dondurucu (-20 °C)	VWR (VWR)	97043-346
Dondurucu ( -80 °C)	Termo Bilimsel	EXF40086A
Cam şişeler	Balıkçı Bilimsel	03-339-26D	Liyofilize kriyofrezelenmiş ECM'yi saklamak için
Sıvı nitrojen			Elektro püskürtme için
Liyofilizatör	Laboratuvar Laboratuvarı	7750021	Serbest Bölge4.5
Freze odası	Retsch	02.462.0213	25 mL hacim önerilir
Freze topları	VWR (VWR)	16003-606	10 mm çap, paslanmaz çelik önerilir
Penisilin-streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15140-122	Proliferasyon ortamı için kullanılır
Pipet Yardımı XP	Mandel Bilimsel	DRU-4-000-101
Kepçe	VWR (VWR)	89259-968	Mikro taşıyıcıları toplamak için
Cerrahi makas	VWR (VWR)	82027-590