ECM Süspansiyon Hazırlığı: Doku Kaynaklı Hücre Dışı Matriksten Homojen Süspansiyon Elde Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Kornmuller, A. et al. Dokuya Özgü Hücre Kültürü ve Dağıtım Platformları Olarak Hücre Dışı Matristen Türetilmiş Köpüklerin ve Mikro Taşıyıcıların İmalatı. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, deselüler ve liyofilize dokulardan homojenize edilmiş ve sindirilmiş bir hücre dışı matris süspansiyonunun hazırlanmasını açıklar. Bu teknik, gelişmiş 3D hücre kültürü modellerinde substrat olarak kullanılmak üzere ECM'den türetilmiş gözenekli köpüklerin ve mikro taşıyıcıların üretilmesine yardımcı olur.

Protokol

1. Hücreden Arındırılmış Doku İşleme

1. Decellularization ve liyofilizasyon
   1. Yerleşik bir protokolü izleyerek ilgilenilen dokuları hücreden arındırın.
      not: Bu çalışmadaki iskeleler, insan hücresinden arındırılmış yağ dokusu (DAT), domuz hücresinden arındırılmış dermal doku (DDT) ve domuz hücresinden arındırılmış sol ventrikül (DLV) için yayınlanmış hücre giderme protokollerine göre hazırlanmıştır. Ticari olarak temin edilebilen, çözünmeyen kolajen, 10-50 mg / mL'lik bir konsantrasyon aralığında başarıyla kullanılan sığır tendonundan elde edilen kolajen gibi köpükleri ve mikro taşıyıcıları üretmek için de kullanılabilir. Diğer çözünmeyen kollajen kaynakları kullanılabilir, ancak stabil iskeleler oluşturacak konsantrasyon aralığını belirlemek için optimizasyon gerekebilir.
   2. Hidratlanmış hücreden arındırılmış dokuyu veya saflaştırılmış kollajeni forsepsli 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve dokuyu maksimum toplam 35 mL hacme daldırmak için yeterli çift damıtılmış su (ddH₂O) ekleyin.
   3. Numuneyi gece boyunca -80 °C'de dondurun, sonraki liyofilizasyon sırasında süblimasyon için yüzey alanını en üst düzeye çıkarmak için santrifüj tüpü dondurma sırasında yatay olarak konumlandırılmıştır.
   4. Santrifüj tüpünün kapağını çıkarın ve donmuş numuneyi bir liyofilizasyon kavanozuna aktarın.
   5. Numuneyi bir laboratuvar dondurarak kurutucu kullanarak 48-72 saat veya tamamen kuruyana kadar liyofilize edin.
      not: Kuruma süresi, farklı liyofilizatörler ve decellularized dokular için değişebilir.
   6. Liyofilize ECM'yi keskin cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde (~1–2 mm³) ince bir şekilde kıyın.
   7. Kıyılmış ECM'yi daha sonraki işlemlere hazır olana kadar bir kurutucuda saklayın.
      not: Ortamdan nem emilimini önlemek için kıyılmış ECM'nin hemen kullanılması tavsiye edilir.
2. Kriyofrezeleme
   1. Kıyılmış liyofilize ECM ile bir laboratuvar bilyalı değirmen sistemi için 25 mL'lik bir paslanmaz çelik freze haznesini doldurun ve iki adet 10 mm paslanmaz çelik freze bilyesi ekleyin.
   2. Yüklü freze haznesini kapatın ve 3 dakika boyunca sıvı nitrojene tamamen daldırın.
   3. Dondurulmuş numuneyi 3 Hz'de (30 rpm) 1,800 dakika boyunca ince bir toz haline getirin.
      not: Bu adımların tekrarlanması gereken sayı ECM kaynakları arasında farklılık gösterebilir. Örneğin, DAT tipik olarak ince bir toz oluşturmak için 3 öğütme döngüsü gerektirir.
3. ECM süspansiyon hazırlığı
   1. 250 mg kıyılmış (köpükler için) veya kriyofrezelenmiş (köpükler veya mikro taşıyıcılar için) ECM'yi tartın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kıyılmış ECM ve kriyofrezelenmiş ECM'nin hazırlanması için sırasıyla adım 1.1.6 ve bölüm 1.2'ye bakın.
      not: Bu protokol, insan DAT, domuz DDT ve domuz DLV'si için önerilen 50 mg/mL'lik bir ECM süspansiyonu hazırlamak için tasarlanmıştır. Spesifik ECM kaynağına bağlı olarak, daha yüksek veya daha düşük başlangıç konsantrasyonlarında tek tip süspansiyonlar üretilebilir.
   2. Santrifüj tüpüne 5 mL 0.22 M NaH₂PO₄ (pH 5.4) tamponu ekleyin ve tüp üzerindeki sıvı seviyesini işaretleyin.
   3. 1 mL 0.22 M NaH₂PO₄ (pH 5.4) tamponuna 7.5 mg α-amilaz ekleyerek bir α-amilaz stok çözeltisi hazırlayın. Numuneye 100 μL α-amilaz stok çözeltisi (0.75 mg α-amilaz: kuru doku ağırlıkça% 0.3) ekleyin. 10 mL'lik bir son hacim elde etmek için 0.22 M NaH₂PO₄ ekleyin.
   4. Süspansiyonu oda sıcaklığında 72 saat boyunca 300 rpm'de sürekli olarak çalkalayın.
   5. Süspansiyonu 1,500 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Sindirilmiş ECM peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice toplayın ve atın. Peletlenmiş materyali ddH₂O içinde seyreltilmiş 10 mL% 5 NaCl içinde yeniden süspanse edin.
   6. ddH₂O'da% 5 NaCl ile toplam iki durulama için adım 1.3.5'i tekrarlayın.
   7. Süpernatanı atın ve peletlenmiş malzemeyi 10 mL ddH₂O içinde yeniden süspanse edin.
   8. Süspansiyonu RT'de 10 dakika boyunca 300 rpm'de sürekli olarak çalkalayın.
   9. Süspansiyonu 1,500 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Sindirilmiş ECM peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice toplayın ve atın.
   10. Adım 1.3.2'de yapılan 5 mL işaretine 0,2 M asetik asit ekleyin.
   11. Süspansiyonu 37 °C'de 120 rpm O/N'de sürekli olarak çalkalayın.
   12. ECM süspansiyonunu, 10 mm genişliğinde testere dişli bir prob ile donatılmış bir el tipi homojenizatör kullanarak oda sıcaklığında 10 saniyelik aralıklarla görünür parça kalmayana kadar homojenize edin. Aşırı ısınmayı önlemek için süspansiyonu homojenizasyon aralıkları arasında soğuk su dolu bir behere yerleştirin.
       not: ECM kaynağına bağlı olarak, homojen bir süspansiyon elde etmek için 0,2 M asetik asit içinde daha fazla seyreltme gerekebilir. ECM süspansiyonunun aşırı soğutulması, verimli homojenizasyonu engelleyebilecek viskozitede bir artışa neden olabilir. Viskozitede bir artış tespit edilirse, numune 37 °C'ye yeniden ısıtılabilir ve daha fazla işleme tabi tutulabilir.
   13. Köpük veya mikro taşıyıcı imalatından önce bir aya kadar 4 °C'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetik asit, buzul	Biyo Dükkanı	ACE222.5
α-amilaz	Sigma	101074694	Aspergillus aryzae sitesinden
Santrifüj 75004251	Termo Bilimsel		15 ve 50 mL santrifüj tüpleri için sallanan kova rotoru ile
Santrifüj tüpleri (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Kurutucu	Balıkçı Bilimsel	8624426	Liyofilize ECM ve biyoiskele depolaması için
Çift damıtılmış su (ddH2O)			Barnstead GenPure xCAD Su Arıtma Sisteminden
ECM (Hücre Dışı Matris)			Flynn ve ark. 2010, Reing ve ark. 2010 ve Wainwright ve ark. 2010 (ref # 28, 8, 32)
El tipi homojenizatör	Balıkçı Bilimsel	14-359-251	Hız: 8.000 - 30.000 rpm
Homojenizatör aksesuarları: testere dişi tabanlı jeneratör probları	Balıkçı Bilimsel	14-261-17	10 x 95 mm
Sıvı nitrojen
Sodyum klorür	Biyo Dükkanı	7647-14-5
Sodyum fosfat monobazik	Biyo Dükkanı	10049-21-5
Cerrahi makas	VWR (VWR)	82027-590

Serisi Belediyesi