Liyofilizasyon Yoluyla Hücre Dışı Matris Türetilmiş Köpük İmalatı: Hücreden Arındırılmış Dokuların ECM'sinden Biyolojik İskeleler Oluşturma Prosedürü

Özet

Kaynak: Kornmuller, A. et al. Dokuya Özgü Hücre Kültürü ve Dağıtım Platformları Olarak Hücre Dışı Matristen Türetilmiş Köpüklerin ve Mikro Taşıyıcıların İmalatı. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, kimyasal çapraz bağlamaya gerek kalmadan saf ECM'den türetilmiş köpüklerin sentezlenmesi yöntemi açıklanmaktadır. ECM'den türetilen bu köpükler, gelişmiş 3D in vitro hücre kültürü modelleri veya pro-rejeneratif biyoiskeleler olarak uygulama bulur.

Protokol

>1. ECM'den Türetilmiş Köpük İmalatı

1. ECM ince tozunu tampon çözeltisi içinde dağıtarak homojen ECM süspansiyonunu hazırlayın ve süspansiyon ısınana kadar 120 rpm'de sürekli çalkalama ile 37 °C'de inkübe edin.
2. ECM süspansiyonunu 0,2 M asetik asidik olarak istenen konsantrasyona seyreltin.
   not: ECM kaynağına bağlı olarak, stabil köpükler 10-100 mg / mL aralığında, DAT, DDT ve DLV için önerilen aralık 15-50 mg / mL ile hazırlanabilir. Tipik olarak, daha yüksek konsantrasyonlarda üretilen köpükler biraz daha az gözenekli olacak, ancak kültürde daha kararlı olacak ve kullanımı daha kolay olacaktır.
3. ECM süspansiyonunda kabarcık oluşumunu önlemek için 18G iğneli 3 mL'lik bir şırınga kullanarak, istenen kalıbı ECM süspansiyonu ile doldurun. DAT, DDT ve DLV köpüklerini imal etmek için, 400 μL 35 mg / mL ECM süspansiyonunu 48 oyuklu hücre kültürü ile muamele edilmiş bir plakaya dağıtın.
   not: Seçilen kalıbın şekli ve ECM süspansiyonunun hacmi, ortaya çıkan köpüğün geometrisini belirleyecektir.
4. Kalıpları -20 °C veya -80 °C dondurucuya koyarak gece boyunca örtün ve dondurun.
   not: Donma sıcaklığı köpüklerin gözenekliliğini etkileyebilir. Numuneler -20 °C'de dondurulduğunda, daha büyük buz kristallerinin oluşması nedeniyle -80 °C'ye kıyasla daha büyük gözenekler beklenir. Düzgün gözenekli bir yapıya sahip köpükler üretmek için, yönlü soğutmayı önlemek için kalıbın iletken bir yüzeyle temas halinde olmadığından emin olun.
5. Dondurulmuş numuneleri içeren kalıpları bir liyofilizatör şişesine yerleştirin. Liyofilizatör şişesini laboratuvar dondurarak kurutma sistemine bağlayın ve 24 saat
   kurutun NOT: Liyofilizasyondan önce numunenin donmuş halde kalması önemlidir.
6. Liyofilize köpükleri gerekene kadar bir desikatörde saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Analitik terazi	Sartorius	CPA225D
Santrifüj tüpleri (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Santrifüj tüpleri (50 mL)	Sarstedt	62.547.205
Sığır aşil kollajen tendon (çözünmez)	Sigma	C9879	Veya benzeri çözünmeyen kollajen kaynak; An olarak kullanılabilir Decellularized için alternatif köpükleri imal etmek için dokular ve Mikro taşıyıcılar
Kurutucu	Balıkçı Bilimsel	8624426	Liyofilize ECM ve için Biyoiskele Depolama
Dewar şişesi	Balıkçı Bilimsel	10-196-6	Düşük form; 250 -500 mL hacim aralığı
Çift distile su (ddH_{2} O)			Başlangıç Barnstead GenPure xCAD Su Arıtma Sistemi
D-PBS (Fosfat tamponlu Tuzlu)	avrupa bizonu	311425125
ECM (Hücre Dışı Matris)			İnsan yağı izole edilmiştir doku, domuz dermisi veya domuz Miyokard, Flynn 'da tarif edildiği gibi ve ark. 2010, Reing ve ark. 2010, ve Wainwright ve ark. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Forseps	VWR (VWR)	37-501-32	Köpükleri aktarmak için
Dondurucu (-20 °C)	VWR (VWR)	97043-346
Dondurucu ( -80 °C)	Termo Bilimsel	EXF40086A
Cam şişeler	Balıkçı Bilimsel	03-339-26D	Liyofilize kriyofrezelenmiş saklamak için Ecm
Sıvı nitrojen			Elektro püskürtme için
Liyofilizatör	Laboratuvar Laboratuvarı	7750021	Serbest Bölge4.5
18 G iğne	VWR (VWR)	C ABD305185	ECM süspansiyonunu dağıtmak için kalıplara
Orbital inkübatör çalkalayıcı	SciLogex (İngilizce)	832010089999	Sıcaklık kontrollü (37 °C)
Serolojik pipetler (10 mL)	Sarstedt	86.1254.001
Serolojik pipetler (25 mL)	Sarstedt	86.1685.001
Sodyum klorür	Biyo Dükkanı	7647-14-5
Sodyum fosfat monobazik	Biyo Dükkanı	10049-21-5

Belediyesi Belediyesi Serisi Belediyesi Belediyesi