Elektropüskürtme ile Biyoiskele İmalatı: Hücreden Arındırılmış Dokunun Hücre Dışı Matrisinden Türetilen Mikro Taşıyıcı İskeleler Oluşturma Tekniği

Özet

Kaynak: Kornmuller, A. et al. Dokuya Özgü Hücre Kültürü ve Dağıtım Platformları Olarak Hücre Dışı Matristen Türetilmiş Köpüklerin ve Mikro Taşıyıcıların İmalatı. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, elektropüskürtme ile hücre dışı matristen türetilmiş mikro taşıyıcı üretim prosedürünü göstermektedir. Bu mikro taşıyıcılar, doğal dokuya özgü mikro ortamı simüle eder ve uzun vadeli 3D in vitro hücre kültürü modellerinde stabildir.

Protokol

1. Elektropüskürtme Yoluyla ECM'den Türetilmiş Mikro Taşıyıcı İmalatı

NOT: Elektropüskürtme kurulumuna genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Önceden hazırlanmış cryomilled ECM süspansiyonunu 37 °C'de 100 rpm O/N'de sürekli çalkalama ile inkübe edin.
   not: Cryomilled ECM, süspansiyonda daha fazla homojenlik sağlamak ve elektropüskürtme sırasında tıkanmayı önlemek için ECM'den türetilen mikro taşıyıcıları imal etmek için kullanılır.
2. 3 mL ECM süspansiyonunu 3 mL Luer-Lock şırıngaya yükleyin ve şırınganın deliğine kanatlı bir infüzyon seti takın.
   not: Seçimin, ortaya çıkan mikro taşıyıcıların boyutunu ve şeklini etkileyebileceğini kabul eden bir dizi iğne ölçer kullanılabilir. DAT, DDT ve DLV mikro taşıyıcılarını üretmek için 25G'lik bir iğne kullanın.
3. Şırıngayı şırınga pompasının içine sabitleyin. İğneyi bir otoklav standına sabitleyin ve iğne ucunu düşük formlu bir Dewar şişesinin üstünden 4-6 cm mesafede dikey olarak konumlandırın (250-500 mL boyut aralığı önerilir).
4. İğnenin ucuna bir timsah klipsi elektrodu takın ve yüksek voltajlı güç kaynağının pozitif terminaline bağlayın.
5. Termosun kenarına bir alüminyum folyo şeridi (12 x 5 cm) katlayın.
6. Folyonun dış kenarına ikinci bir timsah klipsi elektrodu takın ve bunu güç kaynağının toprak kaynağı terminaline bağlayın.
7. Dewar şişesini üstten yaklaşık 1 cm uzağa kadar sıvı nitrojen ile doldurun, böylece folyonun 3/4'ü suya batırılır.
   not: Dewar şişesini sıvı nitrojen ile dolu tutmak önemlidir. Elektropüskürtme işlemi sırasında sıvı nitrojenin yüzeyi, şişenin üst kısmından 2 cm'den daha az olmamalıdır. Elektropüskürtme sırasında sabit bir seviyeyi korumak için sıvı nitrojenin sürekli olarak yeniden doldurulması gerekir.
8. Şırınga pompasını 30 mL/s infüzyon hızına ayarlayın.
   not: İnfüzyon hızının değiştirilmesi mikro taşıyıcı şeklini ve çapını değiştirebilir, ancak önerilen aralık 25-35 mL / s'dir. Süspansiyonun viskozitesine büyük ölçüde bağlı olsa da, 25 mL/s'nin altındaki akış hızları daha büyük mikro taşıyıcıların oluşmasına neden olabilir. Çok düşük akış hızlarında, mikro taşıyıcıların boyutu ve şekli daha az homojen hale gelebilir. 35 mL/s'nin üzerindeki infüzyon hızlarında, elektro püskürtme yoluyla üretilen damlacıkların homojenliği bozulabilir ve bu da daha geniş bir boyut dağılımına sahip küresel olmayan mikro taşıyıcılarla sonuçlanabilir.
9. 20 kV'luk bir voltaj uygulayın ve elektropüskürtmeyi başlatmak için şırınga pompasını açın.
   not: Voltaj, mikro taşıyıcıların boyutunu ayarlamak için değiştirilebilir ve çap üzerinde infüzyon hızından daha büyük bir etkiye sahip olma eğilimindedir. Önerilen voltaj aralığı 15–25 kV'dir. Voltajdaki bir artışla birlikte mikro taşıyıcı çapında bir azalma beklenir.
10. İnfüzyon tamamlandıktan sonra, Dewar'daki fazla sıvı nitrojeni dikkatlice boşaltın ve mikro taşıyıcıları donmuş kalmalarını sağlamak için ~25 mL sıvı nitrojen içinde asılı bırakın.
11. Sıvı nitrojen ile mikro taşıyıcıları tek bir yumuşak hareketle dökerek hemen 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Dewar'da kalan donmuş mikro taşıyıcıları bir kepçe ile toplayın ve santrifüj tüpüne ekleyin.
    not: Dewar'ın boyutuna bağlı olarak, sıvı nitrojen içindeki mikro taşıyıcılar başlangıçta orta büyüklükte bir kaba dökülebilir ve daha sonra hemen 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarılabilir.
12. Liyofilizasyona hazırlık olarak sıvı nitrojen içindeki mikro taşıyıcıları içeren santrifüj tüpünü küçük deliklerle delikli alüminyum folyo ile kapatın.
13. Kapalı santrifüj tüplerini bir liyofilizatör şişesine yerleştirin. Şişeyi hemen liyofilizatöre bağlayın ve numuneleri O/N.
    kurutun not: Çözülme çökme ve/veya agrega ile sonuçlanabileceğinden, bu adımdan önce çözülmemelerini sağlamak için mikro taşıyıcıları sıvı nitrojen içinde asılı tutmak çok önemlidir. Yukarıda açıklanan elektropüskürtme koşulları kullanılarak 35 mg / mL konsantrasyonda üretilen DAT, DDT ve DLV mikro taşıyıcıları, tipik olarak 350-500 μm arasında değişen bir hidratlı çapa sahip olacaktır. Boyut dağılımı ECM kaynağına bağlı olarak değişebilir.
14. Liyofilize mikro taşıyıcıları gerekene kadar bir desikatörde saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1. Mikro taşıyıcı imalatında kullanılan elektro püskürtme aparatına genel bakış. C: Şırınga pompası ve yüksek voltaj güç kaynağı dahil olmak üzere temel elektropüskürtme ekipmanının düzenlemesini ve ayrıca iğnenin sıvı nitrojen Dewar'ına göre konumunu gösteren resim. B: Voltaj, infüzyon hızı için önerilen aralıklar dahil olmak üzere elektropüskürtme şeması, ve mesaf...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Timsah klipsi uçları	VWR (VWR)	470149-728
Alüminyum folyo	Balıkçı Bilimsel	01-213-101
Santrifüj tüpleri (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Santrifüj tüpleri (50 mL)	Sarstedt	62.547.205
Kurutucu	Balıkçı Bilimsel	8624426	Liyofilize ECM ve biyoiskele depolaması için
Dewar şişesi	Balıkçı Bilimsel	10-196-6	Düşük form; 250 - 500 mL hacim aralığı
ECM (Hücre Dışı Matris)			Flynn ve ark. 2010, Reing ve ark. 2010 ve Wainwright ve ark. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Sıvı nitrojen			Elektro püskürtme için
Liyofilizatör	Laboratuvar Laboratuvarı	7750021	Serbest Bölge4.5
Orbital inkübatör çalkalayıcı	SciLogex (İngilizce)	8.3201E+11	Sıcaklık kontrollü (37 °C)
İmbik standı	VWR (VWR)	470019-526
İmbik standı kelepçesi	VWR (VWR)	21573-606
Güvenlik-Lok Şırınga	Bd	309606	Mikro taşıyıcı üretimi ve ECM süspansiyonunun dağıtımı için 3 mL Luer kilit şırıngası
Kepçe	VWR (VWR)	89259-968	Mikro taşıyıcıları toplamak için
Şırınga pompası	VWR (VWR)	10117-490	Mikroişlemci kontrollü
Yüksek voltajlı güç kaynağı	Gama Yüksek Gerilim Araştırmaları	ES30P-5W/DDPM	Tavsiye edilen 15 - 25 kV gerilim aralığında çalışabilme
Kanatlı infüzyon seti	Terumo	22258092	30 cm boru uzunluğu, 25 G 3/4" önerilir; Diğer iğne göstergeleri kullanılabilir ve mikro taşıyıcı çapını etkileyebilir