Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Yarı Katı Matris Damlacıklarının Hazırlanması (plaka başına < 1 dakika)
- Ameliyat mikroskobunun altındaki bir buz bloğunun üzerine önceden soğutulmuş bir cam kuyu tabanlı plaka yerleştirin. Matrisin alikotunun her zaman buzun üzerinde kaldığından emin olun.
- 2 μL veya 10 μL'lik bir mikropipetleyici ile cam tabanlı plakanın dört köşesinin her birine 1,5 μL'lik bir matris damlası yerleştirin ve cam kuyucuğun kenarından en az damlacığın kendisi kadar büyük bir mesafe bırakın.
- Pipetin ucunu 45 derecelik bir açıyla doğrudan camın üzerine yerleştirin. Matrisi yavaşça pipetleyin. Matris plakaya oturduktan sonra cam tabandan yavaşça uzaklaşın.
not: Matris ve cam arasındaki yüzey gerilimi her seferinde mükemmel bir yarım küre oluşturmalıdır.
- Matris damlacığına yanlışlıkla hava enjeksiyonu, matris damlacığının çapını çok daha büyük hale getirdiğinden ve çıkarılması zor olduğundan, uç boşalmadan hemen önce pipetlemeyi durdurun.
not: Pipetleme elini sabitlemek için ikinci bir el kullanmak, daha doğru yerleştirmeyi kolaylaştırır.
2. DRG'nin Yarı Katı Matris Damlacıklarına Yerleştirilmesi (plaka başına < 2 dakika)
- Matris damlacıklarının bulunduğu plakayı kısa bir süre oda sıcaklığında (~ 1 dakika) bırakın. Bu, matrisi hafifçe sertleştirerek DRG'nin hassas bir şekilde yerleştirilmesini kolaylaştırır.
- Sol elinizde kapalı mikroskobik forseps ile DRG'yi nazikçe kepçeleyin (tutmayın). Yine, küçük, beyaz DRG'ye karşı koyu bir arka plan görselleştirmeyi kolaylaştırır. DRG'yi sağ elinizdeki 21G'lik bir iğnenin ucuna aktarın. Bu transfer, forseps üzerinde artık ortam bırakacaktır.
- 21G iğnesini kullanarak DRG'yi matris damlacığının ortasına yavaşça yerleştirin (Şekil 1). Çoğu zaman, DRG matrisin içine kolayca salınır ve daha sonra iğne ile merkezi olarak konumlandırılabilir.
- DRG iğneye yapışırsa, DRG'yi iğneden matris damlacığına itmek için mikroskobik forsepsleri kullanın. Mikroskobik forsepslerdeki fazla ortamı bir laboratuvar mendili ile uzaklaştırın.
not: Matrise ortamın sokulması, testin çapını, hacmini ve tutarlılığını değiştirecektir. Renkli veya renkli yazıya sahip bir buz bloğu, bu hassas sürecin görselleştirilmesini kolaylaştıran arka plan kontrastı sağlar.
- Plaka dört DRG'ye de sahip olduktan sonra, DRG'nin matris damlacığının merkezinde olduğundan emin olmak için son bir inceleme yapın. 21G iğnesi ile gerektiği gibi ayarlamalar yapın.
- Tamamlanan plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın. Bu, yarı katı matrisi katılaştıracak ve DRG'yi yerine sabitleyecektir.
- Bu işlemi tüm DRG'ler için tekrarlayın. Negatif kontrol olarak DRG olmadan boş matris damlacıklarını yerleştirin.
- Tüm plakaları tamamladıktan ve en az 3 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre maruz bıraktıktan sonra her bir cam tabanlı plakaya %10 FBS ortamı ile 4 mL DMEM ekleyin. Plakayı hafif bir açıyla yerleştirin ve ortamı, matris-DRG üniteleriyle kademeli olarak temas edecek şekilde yavaşça ekleyin.
not: Ortam çok hızlı veya kuvvetli bir şekilde eklenirse, matris ve/veya DRG yerinden çıkabilir.
- Tahlilleri sonraki 48–72 h.
için 37 °C inkübatörde saklayın
not: Tahlillerin periyodik olarak incelenmesi, nöritlerin matris kenarına doğru çevresel büyümesini gösterecektir (Şekil 2). Nöritler matrise giden yolun dörtte üçünden daha büyük olduğunda, hücrelerin plakalanması uygundur.
3. Baş ve Boyun Kanser Hücrelerinin Hazırlanması
>NOT: Bu deneysel tasarımda baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom hücreleri dışındaki hücre hatları kullanılabilir.
- 37 ° C'lik bir inkübatörde tercih edilen şişelerde veya kültür kaplarında% 10 FBS ile DMEM'de skuamöz hücreli karsinom hücre hatlarını koruyun. Hücreleri deney için hazırlamak için, tüm ortamı kültür şişesinden veya kabından emdirin ve PBS ile iki kez yıkayın. 5 dakika boyunca uygun miktarda% 0.025 tripsin ekleyerek hücreleri askıya alın, ardından% 10 FBS ile DMEM uygulayın. 4 mL hücre ve ortam karışımını 6 mL kültür kabına pipetleyin.
not: 6 mL'lik bir kültür plakası, %50'den daha az birleştiğinde bile gereğinden fazla hücre sağlar.
- DRG tahlilinde boyama ve kaplamadan 24 saat önce HNSCC hücre hatlarını farklı koşullara maruz bırakın. Tutarlı bir ortam sağlamak için hücreler kaplandıktan sonra durumu yeniden dozlayın.
not: Fare diseksiyonundan ve DRG'nin matrise implantasyonundan 1-2 gün sonra hücre kültürü kaplarına antikorlar, büyüme faktörleri, sitokinler veya diğer molekülleri ekleyin.
- Hücreleri kaplamadan 1 saat önce floresan hücre boyaları ekleyin (DRG hasadından ve matrise implantasyondan 2-3 gün sonra).
not: Burada kullanılan özel lekeler hücre zarından serbestçe geçer; Bununla birlikte, hücre içi tiyol grupları ile reaksiyona girdikten sonra, leke hücre içinde kalır ve yavru hücrelere geçer. Boyama, tahliller içinde görselleştirmeyi büyük ölçüde kolaylaştırır. Bu geçici lekeler bu tahliller için idealdir, çünkü floresan bu deneylerin zaman çerçevesi olan 2-3 gün boyunca mevcuttur. Aynı zamanda birçok farklı rengin kullanımına izin verir ve floresan proteinle transfekte edilmiş hücre hatları oluşturma ihtiyacını ortadan kaldırır.
- Her hücre durumu için 2 μL 10 mM stok hücre boyasını 2 mL serumsuz DMEM'de karıştırarak 10 μM boya çözeltisi hazırlayın. Hücrelere eklemeden önce bunu 37 °C'ye ısıtın.
- Yapışan HNSCC hücrelerini plaka üzerinde bırakarak 6 mL'lik plaka içindeki kültür ortamını çıkarın. 2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve her plakaya eklenen 10 μM hücre boyası / serumsuz DMEM'in 2 mL'sini çıkarın.
- Hücre boyası ile birlikte 6 mL kültür plakasını 40 dakika boyunca 37 °C inkübatöre geri koyun.
- 40 dakika sonra ortamı aspire edin. 2 mL PBS ekleyin ve ardından aspire edin. Her plakaya 1 mL %0.025 tripsin ekleyin ve bunları 37 °C inkübatörde değiştirin.
- 3-5 dakika sonra% 10 FBS ile 2 mL DMEM ekleyin ve askıya alınan hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın. Hücreleri döndürün ve% 10 FBS ile 1 mL DMEM'de yeniden süspanse edin.
- Hücreleri bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile sayın ve ardından mL başına 300.000 hücrelik bir nihai hücre konsantrasyonu oluşturmak için% 10 FBS ile DMEM ekleyin.
4. Baş ve Boyun Kanser Hücrelerinin Kaplanması
- Matris-DRG tahlilleri ile cam tabanlı plakaları inkübatörden çıkarın.
not: Yine, nöritler matrisin kenarına giden yolun en az% 75'i olduğunda uygundurlar, bu genellikle 2-3 gün sonra ortaya çıkar. Bu en iyi şekilde en az 10X'lik bir hedef kullanılarak görülür.
- Ortamı cam tabanlı plakanın içinde aspire edin. Matrix-DRG ünitelerini çıkarmadan cam kuyusu içindeki ortamı tamamen aspire edin.
- 200 μL'lik bir pipet kullanarak 300.000 hücre/mL ortamın 200 μL'sini çizin. Her matris-DRG tahlilinin üzerine iki damla hücre yerleştirin. Bu adımı, her bir matris damlacığı için gerçekleştirin ve her hücre koşulunun bir plaka üzerinde dört tekrarını oluşturun.
not: Matrisin yarım küre şeklindeki şekli, hücrelerin tahlilin çevresi boyunca bir halka içine yerleşmesine izin verir (Şekil 3a, Şekil 3b). Düzgün tetikli bir pipet bulmak, tek tip damlaların yerleştirilmesini çok daha kolay hale getirir.
- 4X mikroskobu altında benzer hücre sayılarını ve çeşitli hücre koşullarının dağılımını onaylayın.
- Cam tabanlı plakaları 37 °C inkübatöre yaklaşık 60 dk.
yerleştirin
not: Sadece küçük bir hücre ve ortam hacmi (~ 150 μL) olmasına rağmen, tahliller birkaç saatlik inkübatör süresi geçene kadar kurumaz.
- 60 dakika sonra, cam tabanlı plakanın yan duvarı boyunca% 10 FBS ile 4 mL DMEM ekleyin.
not: Bir süre boyunca, hücreler kısmen plakanın dibine yapışır ve ortamı ekleme yöntemi hücreleri rahatsız etmez. Farklı hücre tiplerinin cam tabanlı plakaya yapışmaya başlaması daha fazla veya daha az zaman alabilir.
- Önceki konsantrasyon seviyelerini korumak için şu anda herhangi bir eksojen ilacı veya büyüme faktörünü değiştirin.
- Tahlilleri, mikroskobik olarak incelendikleri durumlar dışında, 37 ° C'lik inkübatöre geri koyun. Bu testin sonuçlarını mikroskobik görüntüleme ile ölçün. Kısaca, 4X mikroskobik bir görüntü kullanarak dört kadran içindeki perinöral invazyon ipliklerini sayın.
not: Tahlillerin fotoğrafla belgelenmesi için 4X objektif ve floresan özelliklerine sahip bir mikroskop yeterlidir. Tahlillerin boyutu, perinöral invazyonun bireysel alanlarını yakalamak için yeterince ayrıntılı olan 4X objektif alanına güzel bir şekilde uyuyor. Perinöral invazyon 24 saat içinde belirginleşir, ancak 48 saatin ötesinde, tümör hücreleri matrisin çevresi boyunca bölündükçe ve istila ettikçe tahlillerin bütünlüğü zayıflamaya başlar. 48 saatin ötesinde, DRG'den önemli miktarda fibroblast akışı vardır ve bu da parlak alan mikroskobu kullanılarak görselleştirmeyi engeller. Bu nedenle, sonuçların bu pencere sırasında en az iki kez 4X mikroskobu ile fotoğrafla belgelenmesi tavsiye edilir (örneğin, tümör hücrelerinin kaplanmasından 24 ve 48 saat sonra). Bunların 3 boyutlu tahliller olduğunu ve tüm tahlili tamamen görüntülemenin zor olduğunu unutmayın. Çoğu perinöral invazyon, plakanın altından bir düzlemde meydana gelir, burada hücreler plakanın tabanının biraz üzerindeki matrise gömülür. Bu düzlem yataya yakın olduğu için, tümör hücreli nöritlerin büyük çoğunluğu 4X'te tek seviyeli bir görüntüde yakalanır.
