Kanser Tarafı Popülasyon Ayrımcılığı Deneyi: Hoechst Boya Akıntı Testi Kullanılarak Kanser Kök Benzeri Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Gilormini, M. et al. Kök Hücre Özelliklerine Sahip Baş ve Boyun Skuamöz Hücreli Karsinom Alt Popülasyonunun İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı veya FACS kullanarak baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından kanser kök benzeri hücrelerin bir alt popülasyonunun izolasyonunu açıklıyoruz. İzole edilmiş yan hücre popülasyonu, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Protokol

1. Hoechst Boya Akış Testi ile Bir Yan Popülasyonun (SP) Seçimi

1. Hoechst 33342 boyası ile 50 milyon hücrenin boyanması
   1. Konik tabanlı iki adet 15 mL steril tüp hazırlayın: biri "Hoechst" ve diğeri "Hoechst ve Verapamil" etiketli. Steril suda 10 mL 5 mM Verapamil hidroklorür çözeltisi hazırlayın. Kök hücreler için kültür ortamını (CM) hazırlayın.
      1. CCM'YI CSC (CM-CSC) için hazırlamak için aşağıdakileri birleştirin: Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM):F12 (1:3, v:v), %5 fetal buzağı serumu (FCS), 0.04 mg/L hidrokortizon, 100 U/mL penisilin, 0.1 g/L streptomisin ve 20 μg/L Epidermal Büyüme Faktörü (EGFR).
   2. Laminer bir akış başlığı altında, hücreleri tripsinize edin. Ortamı çıkarın, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve 75 cm²'lik bir şişe için 1 mL tripsin-EDTA (0,5 g/L) ekleyin. 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin. Ebeveyn hücre hattı için kullanılan bir kültür ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun. Hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın.
      1. CM'yi ebeveyn hücre hattı (CM-P) için hazırlamak için,% 10 FCS, 0.4 mg / L hidrokortizon, 100 U / mL penisilin ve 0.1 g / L streptomisin ile DMEM'i destekleyin.
   3. CM-P'de 10⁷ hücre / mL elde etmek için adım 1.1.2'de elde edilen hücre süspansiyonunu seyreltin. Hücre süspansiyonunu hazırlanan iki tüpe bölün: "Hoechst ve Verapamil" tüpüne 100 μL (10⁶ hücre) ve "Hoechst" tüpüne 4 mL (4 x 10⁷ hücre) koyun.
   4. "Hoechst ve Verapamil" örneğinde, 10 μL 5 mM Verapamil hidroklorür çözeltisi (nihai konsantrasyon: 0.5 mM) ekleyin ve hafifçe karıştırın. 5 μL 1 g / L Hoechst çözeltisi ekleyin (nihai konsantrasyon: 0.1 g / L). "Hoechst" örneğinde, 10⁶ hücre başına (toplam 200 μl) 5 μL 1 g / L Hoechst çözeltisi ekleyin. Bundan böyle, numuneleri alüminyum folyo kullanarak doğrudan ışığa maruz kalmaktan koruyun.
   5. Tüm tüpleri 37 ° C'de 1 saat 30 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin. Hücrelerin çökmesini önlemek için her 15 dakikada bir hafifçe karıştırın.
   6. Tüpleri 250 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve her peleti 2 mL 1x PBS ile yeniden süspanse edin.
   7. Tüpleri 250 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. PBS tamponunda seyreltilmiş 500 μL 5 mg / L propidyum iyodür (PI) içinde "Hoechst ve Verapamil" peletini ve PBS tamponunda seyreltilmiş 4 mL 5 mg / L PI içinde "Hoechst" peletini yeniden süspanse edin.
   8. Agregaları çıkarmak için numune çözeltilerini 70 μm'lik bir hücre süzgecinden aktarın ve akış sitometresinde numune alımı için tüplerde tek hücreleri toplayın. Numuneleri buz üzerinde tutun ve alüminyum folyo kullanarak doğrudan ışığa maruz kalmaktan koruyun.

2. Hoechst Boyası Hariç Yan Popülasyonun Hücre Sıralama ile İzolasyonu

1. Aşağıdaki parametrelerle bir akış sitometrisi sıralayıcısında Hoechst negatif hücre ayrımı gerçekleştirin: UV lazer (355 nm), mavi Hoechst (450/50 BP) ve kırmızı Hoechst (610/20 BP) filtreli UV lazer yolu üzerinde iki dedektör ve iki kollektör.
   1. İlk olarak, boyama ve akış sitometresi kurulumu için pozitif bir kontrol görevi gören "Hoechst" numunesini analiz edin.
   2. Sitometre yazılımını kullanarak, "Global Çalışma Sayfası" penceresinde, "Dot Plot" (sağ üstteki beşinci resim) üzerine tıklayın ve global çalışma sayfasında bir grafik oluşturun. Ordinatta, sağ tıklama ile FSC-A'yı (ileri saçılma) ve apsiste SSC-A'yı (yan saçılma) seçin (Şekil 1A). Aynı şekilde, bir SSC-W ve SCC-H nokta grafiği oluşturun. Bu ikinci nokta grafiğinde, bir P1 bölgesi oluşturmak için "Çokgen kapısı"na tıklayın (on dördüncü sağ üst resim) (Şekil 1B).
      not: P1 bölgesi, tek hücreleri kapsayacak ve çiftleri ayırt edecektir.
   3. İsteğe bağlı: P1'de PI kapılı PI'ye karşı bir FSC-A oluşturarak PI pozitif hücreleri hariç tutun. Bu nokta grafiğinde, PI pozitif ölü hücreleri dışlamak için PI negatif popülasyonunu (P2) seçin.
   4. Sitometre yazılımını kullanarak, "Global Çalışma Sayfası" penceresinde "Nokta Grafiği"ne tıklayın ve global çalışma sayfasında bir grafik oluşturun. Koordinatta, sağ tıklama ile mavi Hoechst-A'yı ve apsiste kırmızı Hoechst-A'yı seçin. Nüfusa sağ tıklayarak "Nüfusu göster" ve P1'i seçin. Bu nokta grafiğinde, ana hücre popülasyonunun solunda bir yan kol olarak görünen negatif Hoechst boya yan popülasyonu (SP) hücrelerini seçmek için bir bölge (P2) oluşturun (Şekil 1C).
2. "Hoechst" örneğini analiz edin ve 10.000 olay toplayın. SP popülasyonunu temsil eden P2 kapısının iyi konumlandırıldığından emin olmak için, SP popülasyonunun ortadan kaybolmasını gözlemlemek için "Hoechst ve Verapamil" örneğini (10.000 olay) analiz edin (Şekil 1D).
3. SP Hoechst boya negatif hücrelerini, adım 1.1.1'de hazırlanan 1 mL CM-CSC içeren 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
4. Hücre sınıflandırmasının sonunda, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL CM-CSC ile yeniden süspanse edin. Bir hücre sayacı kullanarak sıralanmış hücrelerin sayısını sayın ve uygun sayıda hücreyi bir kültür şişesine aktarın (bkz. Tablo 1). CM-CSC ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO₂ atmosferinde inkübe edin.
5. En az 5 x 10⁷ hücre olana kadar hücreleri aynı koşullar altında en fazla iki geçiş için kültürde tutun.

Tablo 1: Hücre sayısına göre kullanılacak kültür şişesi tipi sıralanmıştır. Sıralanan yaklaşık hücre sayısı için kültür şişesi boyutunun ayrıntıları verilmiştir. Kültür şişesi tipi için gerekli olan tripsin hacmi ve ortam hacmi de sağlanır.

Sıralanan hücre sayısı	Kültür şişesi tipi	Tripsin Hacmi (mL)	Kültür Orta Hacmi (mL)
10.000-200.000	6 oyuklu bir plakanın 1 kuyusu veya 3,5 cm'lik bir petri kabı	0,5	2
200.000-1.000.000	1 T25 kültür şişesi	1	4
>1.000.000	1 T75 kültür şişesi	2	10

Sonuçlar

Şekil 1: Hoechst boyası hariç bir yan popülasyonun izolasyonu.(A) FSC-A'ya karşı SSC-A nokta grafiği. (B) SSC-W'ye karşı SSC-H nokta grafiği. (C, D) Hoechst Red-A'ya karşı Hoechst Blue-A nokta grafiği, "Hoechst" tüpü (C) veya "Hoechst ve Verapamil" tüpü (D) kullanılarak.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fetal Buzağı Serumu Altın	GE Sağlık	A15-151
Hidrokortizon suda çözünür	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penisilin / Streptomisin 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM (Ömer Çiçeğ	Gibco (Gibco)	61965-026
F12 Fındık Karışımı (1x) + GlutaMAX-I	Gibco (Gibco)	31765-027
EGF (Türkçe)	Promega	G5021	Çözelti hazırlanmalıdır çok olduğu için kullanmadan hemen önce Kararsız
Heparin	StemcellTM Teknolojileri	7980
B-27 Takviyesi (50x), eksi A vitamini	Gibco (Gibco)	12587-010
Penisilin / Streptomisin 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM (Ömer Çiçeğ	Gibco (Gibco)	61965-026
B-27 Takviyesi (50x), eksi A vitamini	Gibco (Gibco)	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Aşındırıcı, akut toksisite (oral, dermal, soluma) kategori 4
Verapamil hidroklorür	Sigma-Aldrich	V-4629	Akut toksisite (oral, dermal, soluma) kategori 3
Propidyum İyodür	Sigma-Aldrich	P4170 Serisi	Akut toksisite (oral, dermal, soluma) kategori 4
SQ20B hücre hattı	John Little's 'dan hediye Laboratuvar	-
FaDu hücre hattı	ATCC (Uzay Servisi)	HTB-43
BD FACSDiva yazılımı v8.0.1	BD Biyolojik Bilimler	-

Serisi Gazetesi Serisi Serisi Fuar Serisi adet Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Radarı