Metil tiyazolil tetrazolyum veya MTT testi: kanser hücrelerinde metabolik aktivitenin belirlenmesi yoluyla ilaç direncini ölçmek için kolorimetrik bir test

Özet

Kaynak: Sciarrillo, R. et al. İn Vitro Kanser Modellerinde İlaç Direnciyle İlgili Yeni Ek Varyantlarını Tespit Etmek için RNA Dizilemesinin Kullanılması. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, kanser hücrelerinde ilaca bağlı sitotoksisiteyi ölçmek ve metabolik aktivitelerini belirlemek için kolorimetrik test, metil tiyazol tetrazolyum (MTT) testi açıklanmaktadır. Bu tahlil, tetrazolyum tuzlarının, hücrelerin mitokondriyal aktivitesini yansıtan renkli ürünlere metabolik dönüşümüne dayanmaktadır.

Protokol

>1. Lösemik Hücreler için MTT Testi

1. MTT çözeltisini önceden hazırlayın: 500 mg MTT formazanı 10 mL PBS'de çözün ve yaklaşık 1 saat manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın (ışıktan korunarak). Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtre ile sterilize edin.
   not: Çözelti −20 ° C'de 10 mL alikotlar halinde saklanabilir. Çözüldükten sonra doğrudan ışıktan koruyun.
2. Asitleştirilmiş izopropanolü önceden hazırlayın: 2,5 L izopropanol'e 50 mL 2 M HCl ekleyin.
   not: Solüsyonu kullanmadan önce oda sıcaklığında en az bir ay saklayın. İzopropanol doğru şekilde asitleştirilmezse, ortamla çökeltiler oluşturabilir ve spektrofotometrik okumayı tehlikeye atabilir.
3. Büyüme inhibisyonunun daha doğru bir şekilde tahmin edilmesini sağlamak için ayrı bir 96 oyuklu düz tabanlı "Gün 0" (kontrol) plakası hazırlayın: Hücre hattı başına 3 ila 6 kuyucuk ayırın, her kuyucuk için 30 μL büyüme ortamı ve 120 μL hücre süspansiyonu ekleyin (8.000 hücre) ve boşluklara karşılık gelen kuyucuklara (hücre yok) 150 μL büyüme ortamı. Optik yoğunluğu (OD) ölçmek için bu bölümün 1.9 adımından 1.13 adımına kadar ilerleyin.
4. 96 oyuklu düz tabanlı bir deney plakası hazırlayın: 30 kuyuyu ilaç konsantrasyonlarına (her biri üç kopya halinde 10 konsantrasyon), hücreleri kontrol etmek için 10 kuyucuğu ve hücresiz ortamı kontrol etmek için 10 kuyucuğu (boşluklar) ayırın ve çözücü olarak Dimetil Sülfoksit kullanarak bir ilaç seyreltme deksametazon (Dex) hazırlayın.
   not: CEM-WT hücreleri için Dex seyreltme aralığı 2 μM ile 0.97 nM arasındadır. CEM/R30dm, CEM-R5 ve CEM-C3 hücreleri için Dex seyreltme aralığı 640 μM ile 0.33 nM arasındadır.
5. Her Dex seyreltmesinden 30 μL'yi 96 oyuklu plakanın uygun bir kuyucuğuna ekleyin. Her konsantrasyonu üçlü bir kopyaya dahil ettiğinizden emin olun.
6. Kontrol hücrelerine karşılık gelen kuyucuklara 30 μL büyüme ortamı ve boşluklara karşılık gelen kuyucuklara 150 μL büyüme ortamı ekleyin.
7. Katlanarak büyüyen hücreleri hasat edin ve optimum tohumlama konsantrasyonlarında yeniden süspanse edin.
   not: Optimal başlangıç hücresi konsantrasyonlarını belirlemek için, hücreleri çeşitli konsantrasyonlarda tohumlayarak ve en az 4 gün boyunca günlük olarak ölçerek 96 oyuklu bir plakadaki her bir hücre hattının büyüme profilinin değerlendirilmesi önerilir. 72 saat sonra hücrelerin aşırı büyümesini önleyen bir tohumlama konsantrasyonu seçin, çünkü bu, OD değerlerini doyurarak deneyi etkileyecektir. CEM-WT, CEM-C5 ve CEM-R5 için optimal tohumlama konsantrasyonu 8.000 hücre/kuyu iken, CEM/R30dm için 5.000 hücre/kuyudur.
8. İlaç çözeltisini veya büyüme ortamını (kontrol hücrelerine karşılık gelen kuyucuklar) içeren her bir oyuğa 120 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Plakada iyi nem sağlamak için plakanın boş dış kuyularını 150 μL PBS ile doldurun ve plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 72 saat inkübe edin.
9. Her bir oyuğa 15 μL MTT çözeltisi ekleyin ve plakayı maksimum 900 sallama / dk'ya kadar bir plaka çalkalayıcı ile 5 dakika çalkalayın.
10. Plakaları bir hücre kültürü inkübatörüne %5 CO₂ ile 37 °C'ye geri yerleştirin ve 4-6 saat daha inkübe edin.
11. Her bir oyuğa 150 μL asitlenmiş izopropanol ekleyin ve tüm formazan kristallerini iyice yeniden süspanse etmek için çok kanallı bir pipetle iyice karıştırın. Boş kuyucuklarla başlayın ve plakanın başka bir sırasına geçmeden önce uçları iyice duruladığınızdan emin olun.
12. Plakayı oda sıcaklığında (RT) 10 dakika inkübe edin.
13. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, arka plan OD'sini düzelterek doğru bir ölçüm sağlamak için OD'yi 540 ve 720 nm'de belirleyin. Ardından, verileri bir elektronik tablo dosyasına kaydedin ve analiz edin.

2. MTT Testi için Veri Analizi

1. Aşağıdaki formülü kullanarak "Gün 0"daki hücrelerin OD değerlerini hesaplayın:
   OD_{Gün 0} = OD_{kontrol hücreleri} - Ortalama OD_{boş kuyuları}
2. Aşağıdaki formüle göre her ilaç konsantrasyonu için hayatta kalan hücrelerin yüzdesini hesaplayın:
   % İşlem gören hücreler = Ortalama [OD_{ile tedavi edilen hücreler} - Ortalama OD_{boş kuyucukları} - OD_{Gün 0}]/[OD_{kontrol hücreleri} - Ortalama OD_{boş kuyucukları} - OD_Gün0]*100
3. Doz-yanıt eğrisini çizin (% olarak ilaç konsantrasyonu ve büyüme inhibisyonu).
4. Doz-yanıt eğrisini kullanarak hücrelerin büyümesini% 50 (IC50) oranında inhibe eden ilacın konsantrasyonunu hesaplayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CCRF-CEM (İngilizce)	ATCC, Manassas, VA, Amerika Birleşik Devletleri	ATCC CCL-119
dev/dak-1640 dev/dak	Gibco, Carlsbad, Kaliforniya, Amerika Birleşik Devletleri	11875093
Fetal sığır ve buzağı serumu	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya	758093
penisilin G streptomisin sülfat	Gibco, Carlsbad, Kaliforniya, Amerika Birleşik Devletleri	15140122
Tris(hidroksimetil)-aminometan	Sigma Aldrich	252859
CELLSTAR Hücre Kültürü Şişeleri 25 santimetre kare	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya	82051-074
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-okuyucu 2001	Labtec, Heerhugowaard, Hollanda		UV-Vis 96 kuyulu plaka spektrofotometresi
Greiner CELLSTAR 96 kuyulu plakalar	tes Greiner/Sigma	M0812-100EA
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (NaCl% 0.9)	B.Braun Melsungen AG, Almanya	362 3140
Tripsin/EDTA Çözeltisi 100 ml	Lonza, Basel, İsviçre	CC-5012

Serisi · · Serisi Serisi Serisi