DAPI Boyama Kullanılarak Hücre Ölümü Taraması: Kanserli Hücre Hatlarında IR ile İndüklenen Klonojenik Hücre Ölümünün Hızlı Taraması İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Kobayashi, D. et al. Floresan Mikroskobu ile Radyasyona Bağlı Klonojenik Hücre Ölümü Modunun Değerlendirilmesi için Tek Adımlı Protokol. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, DAPI boyama testi kullanarak iyonlaştırıcı radyasyonun (IR) neden olduğu kanser hücre hatlarında ana hücre ölümü profillerini tarama metodolojisini göstermektedir. Hücre ölümü geçiren hedef hücrelerin DAPI ile boyanmış çekirdekleri farklı morfolojiler sergiler ve floresan mikroskobu ile kolayca tanımlanabilir.

Protokol

1. Malzemelerin Hazırlanması

1. Otoklav lameller
   1. Lamelleri bir cam kabın içine yerleştirin.
   2. Cam kabı folyo ile örtün.
   3. 121 °C'de 15 psi'de 20 dakika otoklav.
   4. 50 °C'de kurutun. Oda sıcaklığında bir kültür davlumbazında saklayın.
2. Fiksasyon Çözeltisini Hazırlayın: Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 3 paraformaldehit +% 2 sükroz
   1. 1.000 mL'lik bir cam şişeye 700 mL PBS ve 30 g paraformaldehit ekleyin.
      Dikkat: Paraformaldehit aşındırıcıdır, uygun eldiven giyin.
   2. Paraformaldehiti bir mikrodalga kullanarak 80 °C'ye ısıtarak tamamen çözün.
      Dikkat: Paraformaldehit dumanları zehirlidir, maske takın.
   3. Gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.
   4. 20 gr sükroz ekleyin.
   5. Toplam hacmi 1 L yapmak için PBS ekleyin.
   6. 50 mL'lik tüplerde alikot. Fiksasyon Çözeltisi -20 °C'de 3 yıl veya 4 °C'de 3 ay saklanabilir.

2. Işınlama

DİKKAT: X-ışını ışınlayıcıyı üreticinin talimatlarına göre dikkatli bir şekilde kullanın.

1. Hücreleri ters faz mikroskobu altında inceleyin. Hücrelerin lamel üzerine bağlı ve canlı olduğunu onaylayın.
2. Çanağı 6 Gy X-ışını (1,4 Gy/dk, 300 KVP, 20 mA) ile ışınlayın.
3. % 5 CO₂.
   içeren bir atmosferde 37 ° C'de 72 saat inkübe edin not: Kuluçka süresi deney tasarımına göre değiştirilebilir

3. Fiksasyon

1. Çanaktan kültür ortamını aspire edin.
2. Makas kullanarak 1.000 μL'lik bir mikropipet ucunun ucunu uçtan 5 mm kesin.
   not: Kesilen uç, Sabitleme Solüsyonunun düzgün bir şekilde uygulanmasına yardımcı olur.
3. Kesilen ucu kullanarak, yemeğin yan duvarından yemeğe 1 mL Fiksasyon Solüsyonu (adım 1.2'de hazırlanmıştır) ekleyin.
   not: Bu adım zamana duyarlıdır ve bu nedenle birden fazla numuneyi tutarken mikropipet uçlarını değiştirmeden gerçekleştirilmelidir. Fiksasyon Solüsyonunun doğrudan tabağın dibine uygulanması hücrelere zarar verebilir.
4. Çanağı kare bir kültür tabağına yerleştirin. Sabitleme Solüsyonunu lamel üzerine eşit şekilde dağıtmak için kare kültür kabını hafifçe sallayın.
5. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
6. Tabaktan aspire etme Fiksasyon Çözeltisi.
7. Yemeğin yan duvarından yemeğe 2 mL PBS ekleyin.
   not: PBS'nin doğrudan yemeğin dibine uygulanması hücrelere zarar verebilir.
8. PBS'yi çanaktan aspire edin.
9. 3.7 ve 3.8 adımlarını iki kez tekrarlayın.
   not: Çanak, lameller 2 mL PBS'de yıkanarak 4 ° C'de 1 hafta boyunca saklanabilir.

4. DAPI Boyama

1. Bir cam slayta 5 μL 1 μg/mL DAPI boyama reaktifi uygulayın.
   not: DAPI boyama reaktifi, -20 ° C'de veya altında ışıktan korunarak saklandığında 6 ay boyunca stabildir.
2. Bir neşter kullanarak, lameli tabaktan çıkarın.
3. Lamel üzerindeki fazla PBS'yi, lamel kenarına bir kağıt havluyla dokunarak çekin.
4. Hücrelerin DAPI boyama reaktifine maruz kalması için lamel cam slayt üzerindeki DAPI boyama reaktifinin üzerine baş aşağı monte edin.
   not: Bu adım zamana duyarlıdır. DAPI boyama reaktifinin kurutulması, optimal olmayan lekelenmeye yol açabilir.
5. Numuneler -20 °C'de 1 yıl saklanabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kapak fişi	Matsunami	C013001
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148-1KG
Sakaroz	Sigma-Aldrich	84097-250G
Fosfat tamponlu tuzlu su	Cosmo Biyografi	16232000
neşter	Kai Medikal	No.20, 520-A
35 mm hücre kültürü kabı	doğan	353001
Ters Faz Mikroskobu	Şimazu	114-909
X-ışını ışınlayıcı	Faxitron Biyotik	Faxitron RX-650
Kare Kültür Tabağı	Corning	431110
sürgülü cam	Matsunami	Pro-11 (İngilizce
DAPI boyama reaktifi	Hücre Sinyalizasyonu	8961S
Floresan mikroskobu	Nikon	TUTULMA Ni
floresan mikroskobu DAPI filtresi	Nikon	U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
floresan mikroskop lensi (20×)	Nikon	Plan Apo λ 20X/0.75
Floresan Mikroskop Lensi (60×, Yağ)	Nikon	Plan Apo λ 60X/1.40 yağ
yağ	Olympus	N5218600
CCD kamera	Nikon	DS-Qi2
Dijital Görüntü Elde Etme Yazılımı	Nikon	NIS-Elements Belgesi
Lens temizleyici	Olympus	OT0552
kloroform	Wako (Vahşi)	035-02616

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi ) Serisi Serisi