Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Decellularized Özofagus İskelesinin Hazırlanması
- Gıda üretimi için kullanılan taze kesilmiş Landrace domuzlarından bir mezbahada bozulmamış domuz özofajisi elde edin. Tek bir yemek borusu yaklaşık 30 ayrı yapı için yeterli iskele sağlayacaktır.
not: Gerekli kapsamlı ve zaman alıcı sterilizasyon protokolü nedeniyle, normalde bir seferde en az 10 özofaji elde etmeye ve işlemeye değer.
- Taze eksize edilmiş yemek borusunu, herhangi bir kontamine edici mikrobiyal yükü azaltmak için 5 dakika boyunca yaklaşık 150 mL% 10 povidon-iyot çözeltisi içeren 180 mL'lik steril bir tencereye yerleştirin. Yemek borusunu 200 IU/mL penisilin, 200 μg/mL streptomisin ve 1.25 μg/mL amfoterisin B içeren yaklaşık 100 mL steril PBS içeren ikinci bir kaba aktarın.
- Kabın kapağını değiştirin ve yemek borusunu oda sıcaklığında laboratuvara geri taşıyın. Boyutlarına bağlı olarak her kapta iki veya üç özofaji taşınabilir.
- Laboratuvara geldikten sonra, mikrobiyal kontaminasyonu en aza indirmek için dokuyu aseptik teknik kullanarak laminer bir akış başlığında tutun. Cımbızları, makasları ve neşter bıçaklarını %70 etanolde 5 dakika bekleterek ve steril PBS'de durulayarak sterilize edin.
- Yemek borusunu steril cımbız kullanarak tutun. Makası kullanarak yemek borusunu uzunlamasına kesin. Yemek borusunu yaklaşık 100 mL steril PBS içeren 180 mL'lik steril bir tencereye yerleştirerek ve kalıntıları gidermek için hafifçe çalkalayarak dokuyu durulayın.
- Bir mantar diseksiyon tahtasını bolca %70 etanol püskürterek temizleyin ve kurumasını bekleyin.
- Yemek borusunu PBS'den çıkarın ve steril iğneler kullanarak yemek borusunu mukozal yüzey en üstte olacak şekilde tahtaya sabitleyin. Yemek borusunun bir ucundaki mukozal yüzeyi steril cımbızla kavrayın ve tahtadan çekin. Bu, mukozayı alttaki submukozadan ayıracaktır.
- Ardından, yemek borusunu lamina propria boyunca uzunlamasına incelemek için steril bir neşter bıçağı kullanın ve diseksiyon ilerledikçe mukozanın kaldırılmasına izin vermek için pimleri çıkarın.
- Diseke edilmiş mukozayı koruyun ve altta yatan submukozayı atın.
- Mukozanın en proksimal ve distal 2 cm'sini kesin ve atın, çünkü bu bölgelerde sırasıyla daha fazla sayıda submukozal bez ve daha kalın bir lamina propria vardır.
- Kalan dokuyu 5 cm2'ye kesmek için bir neşter kullanın. Tüm kesilen dokuyu yaklaşık 150 mL steril PBS içeren 180 mL'lik steril bir kaba koyun ve dokuyu durulamak için hafifçe çalkalayın. Bir seferde beşten fazla özofagi işleniyorsa, bunun ve sonraki üç adım için birden fazla kap kullanmak gerekebilir.
- Steril cımbız kullanarak, kesilen dokuyu 150 mL steril 1 M NaCl, 200 IU / mL penisilin, 200 μg / mL streptomisin ve 1.25 μg / mL amfoterisin B içeren 180 mL'lik bir tencereye aktarın. 37 ° C'de 72 saat inkübe edin.
- Dokuyu 150 mL steril PBS içeren 180 mL'lik taze bir tencereye koyun. Epitel, alttaki dokudan gözle görülür şekilde ayrılmaya başlamış olacaktır. Ayrılan epiteli steril forseps kullanarak domuz yemek borusundan nazikçe soyun ve atın.
- Kalan dokuyu 180 mL'lik taze bir tencereye koyun ve 150 mL steril PBS ekleyin. Yıkamak için 5 dakika hafifçe çalkalayın. PBS'yi dökün ve taze PBS ile iki kez daha tekrarlayın.
- Tüm dokuyu oda sıcaklığında 24 saat boyunca 400 mL steril% 80 (h / h) gliserol çözeltisi içeren 500 mL'lik bir cam şişeye koyun. 24 saat daha 400 mL steril% 90 (h / h) gliserol çözeltisine aktarın.
- Bazal membranın bütünlüğünü korurken dokuyu kurutmak ve sterilize etmek için oda sıcaklığında 400 mL steril% 100 gliserol solüsyonunda en az 4 ay saklayın.
