Manyetik Boncuk Bazlı Eksozom Ekstraksiyonu: Biyoakışkanlardan Belirli Eksozomları İzole Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Tu, M. et al. Elektrik Alan Kaynaklı Salınım ve Ölçüm (EFIRM) ile Ekzozomal Biyobelirteçlerin Tespiti. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, manyetik mikro boncuklar kullanarak eksozomları hedef biyoakışkanlardan izole etmek için bir prosedür gösteriyoruz. Prosedür, aşağı akış analizi için kullanılabilen eksozomların hızlı bir şekilde yakalanmasını sağlar.

Protokol

1. Manyetik Boncuk Tabanlı Eksozom Ekstraksiyonu

1. Boncukları yeniden süspanse etmek için bir mikrosantrifüj tüpünde 495 μL fosfat tamponlu salin (PBS) tamponuna 5 μL Streptavidin kaplı manyetik mikropartiküllerden oluşan iyi karıştırılmış bir çözelti pipetleyin. Boncukları manyetik bir raf kullanarak 500 μL PBS ile üç kez yıkayın ve yeniden süspanse edin. Raf, numune mikrosantrifüj tüplerini tutabilen bir muhafaza ünitesinin yan tarafında bulunan bir dizi mıknatıstır.
   1. Her yıkama için önce tüpleri 1 dakika rafta bekletin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatan tamponu dikkatlice çıkarmak için bir pipet ucu kullanın.
   2. Tüpleri yanlarında mıknatıs olmayan normal bir rafa yerleştirin. Tüplere 500 μL PBS ekleyin ve çözeltiyi ve boncukları karıştırmak için pipeti kullanın. Ardından, boncukları çözeltiden tekrar ayırmak için tüpleri manyetik rafa geri koyun.
   3. Tamponun bu şekilde çıkarılmasını, PBS'de manyetizasyon ve yeniden süspansiyon yoluyla toplam üç kez gerçekleştirin. Bu, manyetik parçacıkların ilk yıkamasını gerçekleştirir.
2. Boncukları 490 μL PBS tamponuna yeniden süspanse edin ve tüp, manyetik rafın manyetize edilmemiş kısmına yerleştirildi. 1.0 mg / mL stok konsantrasyonunda 5 μL biyotinile fare anti-insan CD63 antikorunu boncuk karışımına pipetleyin. Çözeltideki boncukları ve antikoru karıştırmak için pipeti kullanın.
3. Mikrosantrifüj tüplerini bir boncuk ve biyotinile antikor karışımı ile bir numune döndürücü üzerine yerleştirin. 90°'de karşılıklı dönüş, 5 saniye eğme ve 5 saniye boyunca 1°'de titreşme için numune döndürücü parametrelerini ayarlayın. Örnek-boncuk karışım tüplerini RT'de 30 dakika boyunca bu parametrelerde döndürün.
4. Konjugasyondan sonra bağlanmamış antikoru çıkarın.
   1. RT'de 30 dakikalık dönüşün ardından, tüpleri 5 dakika boyunca manyetik rafa geri yerleştirin.
   2. Bir mikropipet kullanarak sıvı fazı çıkararak üç boncuk yıkama gerçekleştirin ve 500 μL PBS ile yıkayın. Üçlü yıkamadan sonra, boncukları 490 μL kazein-PBS içinde yeniden süspanse edin ve rafın manyetize edilmemiş kısmına yerleştirin.
5. Antikor kaplı boncuklar kullanılarak eksozom ekstraksiyonu.
   1. Her tüpü hedeflenen numune kimliği ile etiketleyin. 10 μL'lik bir serum veya tükürük örneğini mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Numuneyi ve manyetik boncukları birkaç kez pipetleyerek karıştırmak için pipeti kullanın.
   2. Numune ve anti-insan CD63 antikor boncukları içeren tüpleri döndürücüye yerleştirin ve RT'de 2 saat döndürün. Adım 1.3'te açıklananla aynı döndürücü parametrelerini kullanın.
   3. Numunenin 2 saat döndürülmesinin ardından, boncukları çözeltiden ayırmak için manyetize ederek, sıvı fazı bir mikropipetle çıkararak ve boncukları 500 μL Tris-HCl tamponunda yeniden süspanse ederek üçlü bir yıkama gerçekleştirin. Elde edilen boncuklar artık eksozomlara bağlanmıştır ve elektriksel alan salınımı ve ölçümü için hazırdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Biyotinile anti-insan CD63 Antikoru	Ancell, Amerika Birleşik Devletleri	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, Amerika Birleşik Devletleri	65601
Neodinyum Manyetikler (1/10" çap x 1/32" kalınlık)	K&J Manyetikler, ABD	DH101
Ultra saf damıtılmış su	Yaşam Teknolojileri, ABD	10977-023
Anti-Floresein-POD, Fab parçaları	Roche, Almanya	11426346910
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su Çözeltisi	Yaşam Teknolojileri, ABD	10010023
Kazein/PBS	Fisher Bilimsel, Amerika Birleşik Devletleri	37532