$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Doku Sindirimi
- 100 mm'lik bir doku kültürü plakası kullanarak, otoklavla sterilize edilmiş diseksiyon makası ve cerrahi forseps kullanarak dokuyu mekanik olarak ~ 1-2 mm boyutunda ince parçalar halinde doğrayın (Şekil 1B, C). Parçalar arasındaki bağ dokusu, uygun ayrılmayı sağlamak ve sonraki adımlarda kolaylık sağlamak için kesilmelidir.
- Kıyılmış dokuya 6 mL dispas / kollajenaz çözeltisi ekleyin. Daha sonra 37°C'de yaklaşık 30 dakika ila 1 saat inkübe edin.
- 5 mL serolojik pipetle 15-20 kez pipetleyerek dokuyu bozun.
- 37°C'de 30 dakika ila 1 saat daha inkübe edin.
- Adım 1.3 ve 1.4'ü iki-üç kez daha veya doku bir bulamaç gibi olana ve pipet açıklığından kolayca geçebilene kadar tekrarlayın (Şekil 1D).
not: Doku örneğinin başlangıç boyutu ve doku kıyma işleminin ne kadar ince olduğu, 1.3 ve 1.4 numaralı adımların kaç kez tekrarlanması gerektiğini belirleyecektir. Tipik olarak, yaklaşık 1 cm x 1 cm boyutunda doku alırız. Ek olarak, dokudan hücre ayrışmasının ilerlemesini izlemek için standart bir ters doku kültürü mikroskobu kullanılarak doku ayrışması izlenebilir. Küçük hücre kümeleri, tükürük hücrelerinin tükürük hücreleri olarak ilk büyümesi için idealdir.
2. Kuyuların Bodrum Membran Matrisi ile Kaplanması
NOT: Bazal membran matrisi (BMM), kullanılacağı gün önce gece boyunca 4°C'de çözülmelidir. Çözüldükten sonra, BMM, daha yüksek sıcaklıklarda hızla katılaşacağı (yani bir jel oluşturacağı) için sürekli olarak buz üzerinde veya 4 ° C'de tutulmalıdır. Ek olarak, soğuk numuneler BMM'yi "eriteceği" ve hücreleri plastik tabağa maruz bırakacağı için, BMM üzerine kaplamadan önce numunelerin buz üzerinde soğutulup soğutulmadığına dikkat edilmelidir.
- BMM'yi (Malzeme Tablosuna bakın) kaplanacak her bir oyuğa yavaşça pipetleyin. BMM'yi kuyuya eşit ve yavaş bir şekilde dağıtın.
NOT: Genel olarak, 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuklu için 500 μL kullanırız, ancak bu hacim, 12 oyuklu veya 24 oyuklu gibi diğer plaka varyantlarında kullanım için veya daha kalın veya daha ince hidrojeller için istenildiği gibi ayarlanabilir.
- BMM'nin katılaşmasına izin vermek için kaplamalı plakaları kullanmadan önce en az 37 dakika boyunca 15 ° C'de inkübe edin.
3. Sindirilmemiş Dokunun Filtrelenmesi, RBC Lizisi ve Hücre Kaplaması
- Doku homojenatını adım 1.5'ten 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri aktarmak için plakayı 6 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile bir kez yıkayın.
- Sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için homojenatı 70 μm'lik bir naylon ağ hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe süzün. Süzülmüş hücreleri 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- 1x çalışma çözeltisi elde etmek için 10x RBC lizis tamponunu steril dH2O'daseyreltin.
- Süpernatanı aspire edin. Daha sonra, hücre peletini 10 mL 1x RBC lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin. 37°C'de 5 dakika inkübe edin.
- RBC lizis tamponunu nötralize etmek ve tükürük hücrelerinin parçalanmasını en aza indirmek için 20-25 mL DPBS ekleyin. 500 x g.
'de 5 dakika santrifüjleyin
not: RBC lizis tamponu ile muameleden sonra, hücre peleti beyaz olmalıdır. Peletteki kırmızı renk, tüm RBC'lerin tamamen parçalanmadığını gösterir. Tüm RBC'nin tam parçalanması için gerekirse 3.4'ten 3.5'e kadar olan adımları tekrarlayın.
- Süpernatanı aspire edin. Peletleri oyuk başına 1-2 mL BEGM içinde yeniden süspanse edin, ardından yeniden süspanse edilmiş hücreleri BMM kaplı oyuklara yerleştirin. 37°C'de inkübe edin.
- BMM'ye kaplandıktan sonra, hücreler 2-3 günlük bir süre içinde küresel yapılara veya "tükürüklere" dönüşecektir. Hücreler, BMM bozulmaya başlamadan önce yaklaşık 5-7 gün tükürük küreleri olarak tutulabilir, bu da hücrelerin plastiğe erişmesine ve yapışmasına ve tek tabaka olarak büyümesine izin verir.