1. Nanoparçacık Problarının Hazırlanması
>NOT: Bu test, nötravidin polimerleri (AV) ile kovalent olarak konjuge edilen ve DFM aydınlatması üzerine kırmızı (641 nm tepe) saçılma sinyali üreten bir yüzey plazmon rezonans zirvesine sahip İşlevselleştirilmiş Altın Nanoçubukları (AuNR'ler; 25 nm çap x 71 nm uzunluk) kullanır.
- 40 μL AuNR-AV'yi (2.56 x 1011 parçacık) 200 μL PBS (pH 7.0) ile santrifüjleme ve aspirasyon (10 dakika boyunca 4 ° C'de 8.500 x g) ile üç kez yıkayın, ardından son bir santrifüjleme ve aspirasyon adımı izleyin, ardından AuNR-AV peleti 40 μL PBS'de süspanse edilir.
- Bu AuNR-AV süspansiyonunu, ilgilenilen eksozom alt tipinin yüzeyindeki bir antijene özgü 10 μL biyotinile antikor (0.5 mg / mL) ve 150 μL PBS ile karıştırın ve daha sonra nötravidin-biyotin bağlanmasının tamamlanmasını sağlamak için bir karıştırıcı kullanarak 2 saat boyunca 4 ° C'de karıştırın.
- Elde edilen antikor konjuge AuNR'leri (AuNR-IgG) santrifüjleme ve aspirasyon ile üç kez yıkayın (10 dakika boyunca 4 ° C'de 6.500 x g) ve ardından 200 μL PBS'de süspanse edin ve kullanılana kadar 4 ° C'de saklayın.
not: AuNR-IgG'nin kontaminasyonunu ve bozulmasını önlemek için steril teknik ve kısa saklama süreleri kullanılmalıdır. Antikor ile konjuge AuNR'leri konjugasyonlarından sonraki 24 saat içinde kullanmak en iyisidir.
2. EV Yakalama Slaytlarının Hazırlanması
- Seçilen eksozom yakalama antikorlarını PBS'de 0.025 mg / mL'ye seyreltin ve bu seyreltmenin 1 μL / oyusunu çok kuyulu bir protein A / G lamı üzerine ekleyin ve daha sonra bu slaytı nemlendirilmiş bir odada 37 ° C'de 1 saat inkübe edin
.
- Bağlanmamış antikorları çıkarmak için oyukları aspire edin ve 1 μL/kuyucuk PBS ilavesi ve aspirasyonu ile üç kez yıkayın. Daha sonra, her bir kuyucuğu 1 μL bloke edici tampon ile yükleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kalan protein bağlanma bölgelerini bloke etmek için slaytı nemlendirilmiş bir odada 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
- Bloke edici tamponu çıkarmak için kuyucukları aspire edin, 1 μL / kuyu PBS ilavesi ve aspirasyonu ile kuyuları üç kez yıkayın ve eksozom yakalama ve analizi için tıkalı slaytları hemen kullanın.
>3. Standart Eğri Hazırlığı
- Belirli bir eksozom alt tipinin mutlak veya nispi bolluğunu doğru bir şekilde ölçmek için, kullanıcının, ilgilenilen eksozom yüzey biyobelirtecini tek tip olarak ifade eden saf bir eksozom popülasyonuna sahip standart bir eğri oluşturması gerekir. Bu çalışma, pankreas kanseri evresi ve prognozu ile bildirilen bir ilişkisi olan metastaz ile ilişkili bir zar proteini olan Ephrin A2 reseptörünü eksprese eden eksozomların bolluğunu analiz etmektedir.
not: İnsan pankreas kanseri hücre hattı PANC-1 ve eksozomlarının bu proteini eksprese ettiği bilinmektedir ve bu hücre hattından izole edilen eksozomlar, karmaşık eksozom örneklerinde bu proteini eksprese eden eksozomların sayısını ölçmek için standart bir eğri oluşturmak için kullanılmıştır.
- Ortamda eksozom birikimine izin vermek için serumsuz kültür ortamında 37 ° C'de 48 saat boyunca kültür hücreleri, daha sonra süspansiyon kültürlerinin santrifüjlenmesi veya kültür ortamının yapışık hücre kültürlerinden doğrudan aspirasyonu ile hücre kültürü süpernatantlarını izole edin.
- Kalıntıları temizlemek ve süpernatanı geri kazanmak için toplanan ortamı 30 dakika boyunca 2000 x g'da santrifüjleyin.
- Arıtılmış kültür süpernatanı, uygun kapasiteye sahip 0.45 μm düşük protein bağlayıcı bir filtre ünitesinden (örneğin, 250 mL polieter sülfon vakum filtrasyon ünitesi) süzün.
- Elde edilen süzüntüyü, 100.000 nominal moleküler ağırlık limitli filtre sistemi kullanarak 3200 x g'da santrifüjleme yoluyla 250 μL'lik bir nihai hacme konsantre edin. Bu filtreden tutulan hacmi toplayın, ardından filtreyi 200 μL PBS ile yıkayın ve bu yıkama hacmini toplanan eksozom numune hacmi ile birleştirin.
- Bu numuneyi 21.000 x g'da 45 dakika santrifüjleyin ve çökelmiş herhangi bir materyal toplamamaya dikkat ederek süpernatanı dikkatlice geri kazanın.
- Eksozomları çökeltmek için geri kazanılan süpernatanı 3 saat boyunca 100.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve eksozom peletini 100 μL PBS'de toplayın.
- Elde edilen eksozom süspansiyonlarını 24 saat içinde kullanılırsa 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -80 °C'de saklayın.
NOT: Eksozom örneklerini donma-çözülme döngülerini tekrarlamaya tabi tutmayın.
- Eksozom sayılarının doğrudan ölçümü ile karıştırıldıktan sonra eksozom süspansiyonunun bir alikotunu ölçün (örneğin, nanopartikül izleme analizi veya ayarlanabilir dirençli darbe algılama ile veya mikro-bikinkoninik asit tahlili veya eşdeğer bir yöntemle eksozom lizatlarının protein konsantrasyonunun ölçülmesi, yaklaşık eksozom miktarını yaklaşık olarak kullanmak için).
- Nanopartikül sinyalinin giriş eksozom sayısı veya protein içeriği ile karşılaştırılmasına izin vermek için eksozom süspansiyonunun bir dizi seri seyreltmesini oluşturun.
- Her eksozom standardının 1 μL'sini tahlil plakasındaki replikasyon kuyucuklarının her birine aktarın.
NOT: Standart eğriler, (1) tahlil performansını değerlendirmek ve (2) deneysel numunelerde hedef eksozomların nispi konsantrasyonunu belirlemek için nanopartikül sinyali ile eksozom konsantrasyonu arasındaki korelasyon çizgisinin eğimini hesaplamak için kullanılabilir.
4. İnsan Plazma veya Serum Örneklerinin İşlenmesi
- Plazma veya serum örneklerini standart yöntemlerle toplayın ve eksozom analizi için gerekli olana kadar -80 °C'de saklayın. Numuneleri oda sıcaklığındaki bir su banyosunda hızla çözün. Homojen süspansiyonu teşvik etmek için çözülmüş numuneleri ters çevirerek tekrar tekrar karıştırın.
NOT: Pıhtılaşma reaksiyonu sırasında önemli miktarda eksozom salınımı olduğu için serum ve plazma örneklerinden elde edilen sonuçlar eşdeğer olmayabilir.
- Protein agregatlarını ve diğer kalıntıları çökeltmek için plazma veya serum örneklerini 500 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Plazma veya serum örneğinin bir kısmını yeni bir tüpe aktarın ve 1: 1 seyreltme oluşturmak için PBS ekleyin. Seyreltilmiş numuneyi uygun şekilde hafif girdaplama veya ters çevirme ile karıştırın. Her bir plazma veya serum süspansiyonunun 1 μL'sini tahlil plakası üzerindeki replikasyon kuyucuklarının her birine aktarın.
5. Eksozom Yakalama ve Algılama
- Tıkalı bir EV yakalama slaytının kuyucuklarını, numune başına 8 kopya kullanarak 1 μL/kuyucuk eksozom numunesi ile yükleyin ve slaydı gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 4 °C'de inkübe edin. Tüm numune kuyucuklarını aspire edin ve ardından kuyucukları yıkamak için 1 μL/kuyu PBS ekleyin ve yüklenen eksozom numunesinden bağlanmamış eksozomları ve diğer kirleticileri çıkarın.
- Numune kuyucuklarını önceden hazırlanmış bir AuNR-IgG süspansiyonunun 1 μL/kuyusu ile yükleyin (yukarıdaki bölüm 1'e bakın) ve slaytı nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 2 saat inkübe edin. Nanopartikül çözeltisini aspire edin ve slaytı bir karıştırıcı kullanarak 10 dakika boyunca %0.01 Tween-20 (PBST) ile desteklenmiş PBS'de yıkayın, ardından tüm numune kuyucuklarını dönen bir karıştırıcı kullanarak 10 dakika boyunca deiyonize su ile aspire edin ve yıkayın ve sonraki LMDFM görüntüleri için havayla kurutun.
NOT: Tahliller arası varyasyon katsayıları (CV'ler) aynı numunenin sekiz tekrarından değerlendirilir. %>20 oranında CV sergileyen numuneler bilgilendirici olmayan olarak kabul edilir ve yeterli numune varsa tekrarlanmalıdır.
