Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Çözümler Hazırlayın
- 120.35 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 15.5 mM NaHCO3, 1.2 mM Na2HPO 4,1.2 mM MgCl2, 11.5 mM glikoz ve 2.5 mM CaCl2 içeren 1 L Krebs-Ringer Bikarbonat (KRB) çözeltisi hazırlayın. Kullanım gününde, KRB çözeltisini ice.
not: KRB, 4 ° C'de bir haftaya kadar saklanabilir ve kullanımdan önce en az 10 dakika boyunca% 97O2 ve% 3 CO2 karışımı ile önceden köpürtülmelidir.
2. Böbreğin vibratom kesiti
- Hazırlanan böbreği buz gibi soğuk KRB solüsyonundan nazikçe kavramak ve çıkarmak için künt uçlu forseps kullanın. Fazla dış nemi gidermek için böbreği hemen ~ 2-4 s boyunca emici kağıda yerleştirin. Parankimin her tarafının kuruduğundan emin olmak için böbreği emici kağıt üzerinde nazikçe yuvarlayın, böylece böbreğin vibratom aşamasına en iyi şekilde yapışmasını sağlayın.
NOT: Renal pelvis böbreğin içinde yer aldığından ve bu nedenle dış parankim tarafından korunduğundan, bu kısa kuruma süresi doku bütünlüğüne zarar vermez.
- Vibratom numune plakasının tabanına hemen ince bir siyanoakrilat yapıştırıcı tabakası (~ 1 cm2) uygulayın ve böbreği üreter tarafı aşağı bakacak şekilde yapıştırıcıyla kaplı alana yerleştirmek için künt uçlu forseps kullanın. Yapıştırıcıyı kurutmak için forsepsin düz kenarı ile böbreğin üst kısmına yaklaşık 10-20 saniye boyunca nazikçe aşağı doğru basınç uygulayın.
not: Bu prosedür sırasında böbreği stabilize etmek için, yapıştırıcı kururken böbreği dik tutmak için ek bir çift forseps kullanın. Böbreğin numune plakasına dik konumda yapışması çok önemlidir, böylece bölümler düz bir şekilde kesilir. Böbreğin numune plakasına başarılı bir şekilde yapıştığından emin olmak için, böbreğin yan tarafını hafifçe itin. Böbrek plakaya başarılı bir şekilde yapışmışsa, böbreğin tabanı plakaya sabitlenmiş kalmalıdır.
- Numune plakasını tampon tepsisinin altına sıkıca sabitleyin. KRB çözeltisinin seviyesini, böbreğin üst kısmı tamamen daldırılacak şekilde ayarlayın. Bölümleme adımları sırasında, vibratom bıçağı tampon tepsisinin daha derinlerine doğru hareket ettikçe, bıçak tutucunun çözeltiye daldırılmaması için KRB çözeltisini çıkarın.
not: Bu adıma geçmeden önce yapıştırıcı tamamen kurumadıysa, yapıştırıcı genellikle tabandan yukarı ve böbrek parankimine doğru hareket edecektir. Bu fazla yapıştırıcı, kesitleri daha değişken hale getirecektir. Bu olursa, böbreği plakadan çıkarın ve taze bir böbrek hazırlığı ile devam edin.
- Otomatik vibratom kesiti için, vibratom bıçağı kesme döngüsünün başlangıç ve bitiş konumlarını seçin. Her bıçak ilerlemesinde tüm böbrek düzleminin bölümlere ayrıldığından emin olmak için bu pozisyonların böbrekten ~ 0,5-1 cm uzakta olduğunu doğrulayın.
- Kuyuları KRB çözeltisi ile doldurarak çok kuyulu bir plaka (24 veya 48 oyuklu) hazırlayın ve plakayı buzun üzerine yerleştirin.
not: Oluşturulduğunda, kesit derinliğini takip etmek için ayrı bölümler ayrı kuyucuklara yerleştirilmelidir.
- Otomatik kesme işlemini başlatın. Bıçağın ilk geçişi sırasında, bıçağın böbreğin en üst kısmı ile temas ettiğinden emin olun. Temas yapılmazsa, bıçağın başlangıç Z konumunu ayarlayın.
- Forseps kullanarak, böbrekten serbest bırakılan bölümleri toplayın. Bölümleri hemen ayrı kuyucuklara aktarın ve böbrek bölümleri içindeki yaklaşık PKJ konumunu ölçmek için bölümlerin Z derinliğine dikkat edin.
not: Kesim parametrelerine bağlı olarak, bazı bölümler böbrek bloğundan serbest bırakılamayabilir. Böyle bir durumda, böbrek bloğundan bölümler kesmek için dikkatlice ince yaylı makas kullanın. Kullanıcılar ayrıca, optimum kesim ayarlarını ve doku konumunu sağlamak için ayrı kuyucuklarda serbest yüzerken, kesitleri bir ışık mikroskobu altında aktif olarak görselleştirmeye teşvik edilir. PKJ içeren bölümler tipik olarak böbreğin tepesinden ~ 1000-1500 μm türetilecektir.
- PKJ bölgeleri daha belirgin hale gelene kadar bölümleme protokolüne devam edin. Bölümlendirme ilerledikçe PKJ bölgelerinin açıklaması için temsili sonuçlar bölümüne bakın.
- Bu noktada, bölümlerin böbrek bloğundan düzgün bir şekilde serbest bırakıldığından ve sağlam olduğundan emin olmak için kesit parametrelerini optimize edin. Ek olarak, PKJ bölgelerinin sürekli ve kırılmamış olduğundan emin olun, çünkü kırık PKJ duvarları, çökme nedeniyle duvar içindeki hücrelerin yeterli görüntülenmesine izin vermeyecektir. Duvarlar kırılırsa, kesit hızını azaltın ve kesit kalınlığını artırın ve kesme parametrelerinde ince ayar yapmak için kesitleri ışık mikroskobu altında gözlemlemeye devam edin.
- Deney başlayana kadar bölümleri KRB çözeltisinde 4 ° C'de saklayın.
