Mesane Tümörü Organoid Modeli: Mesane Organoidlerinin Alıcı Murin Mesanesine Ortotopik Transplantasyonu İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Kim, Y. et al. Fare Mesane Tümörü Organoidlerinin Kültürü, Manipülasyonu ve Ortotopik Transplantasyonu.J. Vis. Uzm.(2020)

Bu videoda, organ ortamının gelişmekte olan tümörler üzerindeki rolünü incelemek için kültürlenmiş mesane tümörü organoidlerinin murin mesanesine ortotopik transplantasyonunu açıklıyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Alt Kültür Mesane Tümörü Organoidleri
 

NOT: Mesane tümörü organoidlerinin çapı 100-150 μm'ye ulaştığında geçmesi önerilir.

1. Tümör organoidleri içeren 24 oyuklu bir plakada organoid ortama 500 μL kollajenaz / dispas ekleyin. Bazal membran matrisini ve ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin. 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın.
   not: Bazal membran matrisinden izole edilen organoidleri mikroskop altında inceleyin. Organoidler bazal membran matrisinden ayrılmazsa, inkübasyon süresini artırın veya daha fazla pipetleyin.
2. 5 mL önceden ısıtılmış DMEM ekleyin, tüpü 400 x g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
3. 1 mL önceden ısıtılmış %0.25 tripsin-EDTA ve 10 μM Y-27632 kullanarak peleti yeniden süspanse edin. 37 °C su banyosunda 5 dakika inkübe edin. Hücreleri kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin ve% 10 FBS ile 5 mL DMEM kullanarak tripsini nötralize edin.
4. Tüpü 400 x g'da 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
5. 1 mL önceden ısıtılmış organoid ortam kullanarak peleti yeniden süspanse edin ve tek tümör hücrelerinin sayısını sayın.

2. Mesane Organoidinin Ortotopik Transplantasyonu (Şekil 1A)

1. Mesane tümörü organoidlerini ortotopik transplantasyon için hazırlayın
   1. Transplantasyondan önce, mesane tümörü organoidlerini yukarıda tarif edildiği gibi 5-7 gün boyunca kültürleyin.
   2. Tümör organoidleri ile 24 oyuklu bir plakada organoid ortama 500 μL kollajenaz / dispas ekleyin. Bodrum membran matrisini ve ortamını yukarı ve aşağı pipetleyin. 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın.
   3. 5 mL önceden ısıtılmış DMEM ekleyin, tüpü 4 ° C'de 3 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
   4. Peletleri 1 mL DMEM ile tekrar süspanse edin ve solüsyonu 90 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
   5. Mikroskop altında, bir P200 mikropipet kullanarak 10-100 tümör organoidini alın ve bunları buz üzerinde bir mikrotüpe toplayın.
   6. Tüpü 400 ° C'de 3 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice atın.
   7. Fareler ameliyata hazır olana kadar hücre peletini buz üzerinde tutun.
2. Submukozal mesane duvarı nakli
   1. Yeni bir ortama alışması için deneyden en az 1 hafta önce 8 ila 10 haftalık bir erkek çıplak fare (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) hazırlayın. Ameliyattan 24 saat önce deri altına enrofloksasin (5 mg / kg) enjekte edin.
   2. Tezgah yüzeyini sabun ve suyla temizleyin. Cerrahi işlemden önce cerrahi aletleri otoklavlayın ve steril aletler kullanarak ameliyat yapın.
   3. 29 G insülin şırıngasını, pipet uçlarını ve bazal membran matrisini buz üzerinde tutun. Anestezi uygulanmadan önce deri altından ketoprofen (5 mg / kg) uygulayın.
   4. Fareyi bir indüksiyon odasında% 4 izofluran ile uyuşturun. Genel anestezi sağlandıktan sonra, fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve% 2 buharlaştırılmış izofluranı maskeleyerek anesteziyi sürdürün.
      not: Anestezi süresi 30 dakikadan fazlaysa, korneanın kurumasını önlemek için pamuklu çubuk kullanarak her iki göze de göz merhemi sürün.
   5. Steril gazlı bezle povidon-iyot uygulayın ve% 70 etanol ile silin. Her seferinde yeni bir gazlı bez veya pamuklu çubukla 3 kez tekrarlayın.
   6. Tek kullanımlık, steril cerrahi örtüler kullanarak anüsü ve cerrahi alanı örtün.
   7. Büyütme için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, steril cerrahi makasla alt orta hat karnının derisinde ve kas duvarında küçük bir enine kesi (1,5 cm'den küçük) yapın. Mesaneyi karın boşluğundan açığa çıkarın ve tuzlu suya batırılmış pamuklu çubuklarla destekleyin.
      not: Mesane idrarla doluysa, hafifçe sıkıştırmak için mesaneye hafifçe bastırın.
   8. Organoid peletleri, %50 yüksek konsantrasyonlu bazal membran matrisi içeren 80 μL organoid ortamda yeniden süspanse edin (Tablo 1 ve Malzeme Tablosu).
   9. Organoid süspansiyonu, diseksiyon mikroskobu altında 29 G insülin şırıngasını kullanarak mesane kubbesinin ön yönüne enjekte edin.
   10. Karın duvarının iç tabakasını antibakteriyel emilebilir sütür ile kapatın ve ardından dış tabakayı 4-0 naylon sütür ile kapatın. Cerrahi bölgeyi povidon-iyot ve% 70 etanol ile dezenfekte edin.
   11. Farenin kızılötesi ışınlayıcı altında iyileşmesine izin verin 10-15 dakika. Bilincini ve hareketliliğini geri kazanana kadar fareyi izleyin.
   12. Ameliyattan bir gün sonra, farenin genel durumunu ve anastomoz sızıntısını kontrol edin. Ameliyat sonrası 3 gün boyunca günde bir kez ketoprofen (5 mg / kg) uygulayın ve ameliyat sonrası 10 gün boyunca günde bir kez enrofloksasin (5 mg / kg) tedavi edin.
   13. Kesi yeri iyileştiğinde (ameliyattan 10-14 gün sonra) dikişleri çıkarın. Tümör organoid enjeksiyonundan sonra 2-3 hafta boyunca fare mesane tümörünün büyümesini izleyin.
   14. Mesane tümörü büyümesi gözlenirse, fareyi karbondioksit soluma kullanarak ötenazi yapın ve tüm mesane tümörünü hasat edin. Soğuk DPBS kullanarak yıkayın (Şekil 1B).
   15. Mesane tümörü histolojisini analiz etmek için, hematoksilen ve eozin (H & E) boyaması kullanarak dokunun parafine gömülü bölümünü boyayın (Şekil 1B).

>Fare mesane tümörü organoid ortamı
İleri DMEM/F-12 (Temel orta)	10 mM HEPES (pH 7.4)
10 mM Nikotinamid	0.5x Serumsuz takviye edici gıda
2 mM L-alanil-L-glutamin dipeptit	% 1 Penisilin / Streptomisin
1 mM N-asetil-L-sistein	50 ng/mL Murin epidermal büyüme faktörü
1 μM A 83-01

Tablo 1: Mesane tümörü organoid ortamının bileşimi.

Sonuçlar

Şekil 1: Mesane tümörü organoidlerinin ortotopik transplantasyonu.(A) Mesane tümörü organoidlerinin çıplak bir fareye ortotopik transplantasyonunun şematik diyagramı. (B) Mesane tümörü organoidleri ile ortopedik olarak nakledilen farelerden mesanelerin ve H&E boyalı kesitlerin temsili görüntüleri. Orta panellerdeki kutulu bölgelerin büyütülmüş gör...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL konik tüp	Spl	50015
24 oyuklu plaka	Corning	3526
29 G 1/2 insülin şırıngası	ŞİNA	B299473538
50 mL konik boru	Spl	50050
A8301	Tocris (Türkçe)	2939	Stok konsantrasyonu: 25 mM
Mutlak etanol	Daejung Belediyesi	4023-2304
Emilebilir sütür	Henry Schein	039010
Gelişmiş DMEM/F-12	Termo	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (çıplak fare)	Charles Nehri	194
Kollajenaz tip I	Termo	17100017	Stok konsantrasyonu: 20 mg/mL
Kollajenaz tip II	Termo	17100015	Stok konsantrasyonu: 20 mg/mL
Kollajenaz / dispas	Sigma	10269638001	Stok konsantrasyonu: 1 mg/mL
DMEM (Dulbecco'nun değiştirilmiş minimum esansiyel ortamı)	Gibco (Gibco)	11965-118
DMSO (Dimetil sülfoksit)	Sigma	D8418
DPBS (Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu)	Welgene (Türkçe)	LB 001-02
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR)	Corning	354230	Plakada organoid kültür için kullanın
Matrigel yüksek konsantrasyon (HC)	Corning	354248	Organoid nakli için kullanın
1,5 mL mikrotüp	Aksiyen	MCT-150-C
Tıraş bıçağı
Tuzlu su tamponu	JW İlaç
Tripsin-EDTA (% 0.25)	Gibco (Gibco)	25200072
Ultrasantrifüj tüpü	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	331372
Y-27632 dihidroklorür	Karın Bezi	M1817	Stok konsantrasyonu: 10 mM

Serisi Serisi Serisi Serisi