İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Probların Hazırlanması
- 7 mm karışım modlu sorbent ile kaplanmış titanyum-nikel alaşımlı problar (40 mm uzunluk; 0,2 mm çap) hazırlayın. Prob sayısı, tüm prosedür boyunca hedeflenen zaman noktalarına ve çoğaltma sayısına bağlıdır (zaman noktası başına 3 önerilir).
not: Ekstraksiyon fazının uzunluğu ve tipi, çalışma moduna, metabolitlerin polaritesine ve numune matrisine bağlı olarak ayarlanabilir.
- 2:1 kloroform:metanol (h/h) içeren bir temizleme karışımı hazırlayın. Her 2,0 mL'lik cam şişeye 1,0 mL çözelti pipetleyin ve daha önce kapaktan delinmiş bir probu her şişeye yerleştirin.
not: Kullanmadan önce, kirletici parçacıkları gidermek için tüm probları temizleyin.
- Şişeleri karıştırıcıya koyun ve çalkalama hızını 1.200 rpm'ye ayarlayın. 45 dakika sonra cihazı durdurun ve kaplamaları LC-MS sınıfı su ile durulayın.
- Kaplamaların etkinleştirilmesi için bir ön koşullandırma adımından geçmesi gerektiğinden, 1:1 metanol:su (h/h) içeren bir ön koşullandırma karışımı hazırlayın. Her 2.0 mL'lik cam şişeye 1.0 mL çözeltiyi pipetleyin ve her şişeye daha önce kapaktan delinmiş bir prob yerleştirin.
- Şişeleri vorteks karıştırıcıya koyun ve çalkalama hızını 1.200 rpm'ye ayarlayın.
- 60 dakika sonra karıştırıcıyı durdurun ve kaplamaları LC-MS dereceli su ile durulayın.
- Probları standart cerrahi ekipman sterilizasyon protokolüne göre sterilize edin.
2. Çıkarma
- Steril bir ortam sağlamak için numune almadan hemen önce steril paketi açın.
- Her zaman noktasında 10 dakika boyunca iki probu doğrudan böbrek korteksine yerleştirin. Kaplamanın tüm uzunluğu doku matrisi ile kaplanmalıdır; Belirli bir açı gerekli değildir, ancak genellikle yaklaşık 90 derece kullanılır.
not: Tüm tıbbi prosedür, belirli bir kurumdaki standart protokolleri takip eder. SPME örneklemesi ile ilgili herhangi bir değişiklik düşünülmemiştir. Prosedür, aşağıdaki altı örnekleme zaman noktasını içerir: a) böbrek rezeksiyonundan önce, in vivo donörden; b)–e) 1 saat, 3 saat, 5 saat, 7 saat böbrek perfüzyonundan sonra, organ odasında ex vivo; f) Reperfüzyondan sonra, in vivo alıcıdan.
- Probları dokudan çekerek geri çekin ve ardından kaplama yüzeyinden kalan kanı temizlemek için kaplamaları LC-MS dereceli su ile durulayın. Cerrahi bölgeden uzakta ve probların çıkarılmasından hemen sonra durulayın.
3. Taşıma ve Depolama
- Probları ayrı şişelere yerleştirin ve kapatın.
- Şişeleri kuru buzla doldurulmuş bir Strafor kutuya veya taşıma için sıvı nitrojen içine yerleştirin.
- Numuneleri bir dondurucuda (-80 °C) saklayın veya hemen desorpsiyon adımına başlayın.
4. Desorpsiyon
- Metabolomik analiz için 80:20 asetonitril:su (v/v) ve lipidomik analiz için 1:1 izopropanol:metanol (h/v) içeren desorpsiyon çözeltileri hazırlayın.
- 100 μL'lik çözeltiyi 2.0 mL etiketli şişelere yerleştirilen eklere pipetleyin ve her şişeye daha önce kapaktan delinmiş bir prob yerleştirin.
- Şişeleri vorteks karıştırıcıya koyun ve çalkalama hızını 120 dakika boyunca 1.200 rpm'ye ayarlayın.
- Probları şişelerden çıkarın. Elde edilen ekstraktlar artık enstrümantal analiz için hazırdır.
5. LC-MS analizi
- Ekstrakt içeren şişeleri LC-MS sisteminin otomatik örnekleyicisine yerleştirin.
not: Bu çalışma için sıvı kromatografisi (RP, HILIC) ile birlikte yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve bir orbitrap kütle analizörü kullanıldı. Metabolomik analiz parametreleri için adım 5.2'ye gidin. Lipidomik analiz parametreleri için adım 5.6'ya gidin.
- Ters faz ayrımı için bir pentaflorofenil (PFP) sütunu (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) kullanın.
- Akış hızını 300 μL/dk'ya ve otomatik numune alma cihazı ve kolon sıcaklıklarını sırasıyla 4 °C ve 25 °C'ye ayarlayın.
- Mobil fazları aşağıdaki oranlara göre hazırlayın: mobil faz A: su: formik asit (99.9: 0.1, v / v) ve mobil faz B: asetonitril: formik asit (99.9: 0.1, v / v). Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: mobil faz akışını başlatma (0–3 dk): %100 A ve ardından %10 A'ya (3–25 dk) doğrusal bir gradyan, 34 dakikaya kadar %10 A'lık izokratik akışla biten, ardından 6 dakikalık kolon yeniden dengeleme süresi.
- HILIC ayırma için bir HILIC sütunu (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A) kullanın. Akış hızını 400 μL/dk'ya ayarlayın.
- Mobil fazları aşağıdaki oranlara göre hazırlayın: mobil faz A: asetonitril: amonyum asetat tamponu (9: 1, v / v, etkili tuz konsantrasyonu 20 mM), mobil faz B: asetonitril: amonyum asetat tamponu (1: 1, v / v, etkili tuz konsantrasyonu 20 mM).
- Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: mobil faz akışını (0-3 dakika) %100 A'da başlatın, 3.0 dakika basılı tutun ve ardından 5 dakika içinde %100 B'ye yükseltin. %100 B ile 12 dakikaya kadar tutun, ardından 8 dakika sütun yeniden dengeleme süresi izleyin.
- Tarama aralığını 85–1000 m/z olarak ayarlayın. Pozitif iyonizasyon modunda HESI iyon kaynağı parametrelerini şu şekilde ayarlayın: püskürtme voltajı 1.500 V, kılcal sıcaklık 300 °C, kılıf gazı 40 au, yardımcı gaz akış hızı 15 au, prob ısıtıcı sıcaklığı 300 °C, S-Lens RF seviyesi %55.
- Cihaz performansını izlemek için analiz edilen her numuneden 10 μL'den oluşan QC numunelerini çalıştırın (düzenli olarak, her 10-12 numunede bir).
- Ters fazlı ayırma için bir C18 sütunu (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm) kullanın.
- Akış hızını 200 μL/dk'ya ve otomatik numune alma cihazı ve kolon sıcaklıklarını sırasıyla 4 °C ve 55 °C'ye ayarlayın. Mobil fazları aşağıdaki oranlara göre hazırlayın: mobil faz A: H2O: MeOH (60: 40, v / v), 10 mM amonyum asetat ve 1 mM asetik asit; mobil faz B: IPA:MeOH (90:10, h/h), 10 mM amonyum asetat ve 1 mM asetik asit.
- Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: 0–1 dk (%20 B), 1–1,5 dk (%20–50 B), 1,5–7,5 dk (%50–70 B), 7,5–13 dk (%70–95 B), 13–17 dk (%95 B), 17–17,1 dk (%95–20 B), 17,1–23 dk (%20).
- HILIC ayırma için bir HILIC sütunu (100 x 2,1 mm, 3 μm) kullanın.
- Akış hızını 400 μL/dk'ya ve otomatik numune alma cihazı ve kolon sıcaklıklarını sırasıyla 4 °C ve 40 °C'ye ayarlayın.
- Mobil fazları aşağıdaki oranlara göre hazırlayın: mobil faz A:ACN; mobil faz B: suda 5 mM amonyum asetat. Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: 0–2 dk (%96 B), 2–15 dk (%96–80 B), 15–15,1 dk (%80–96 B), 15,1–21 dk (%96 B).
- HESI iyon kaynağı parametrelerini pozitif iyonizasyon modunda püskürtme voltajı 3.500 V, kılcal sıcaklık 275 °C, kılıf gazı 20 au, yardımcı gaz akış hızı 10 au, prob ısıtıcı sıcaklığı 300 °C, S-Lens RF seviyesi %55 olarak ayarlayın.
- Cihaz performansını izlemek için analiz edilen her numuneden (her 10-12 numunede bir) 10 μL'den oluşan QC numunelerini çalıştırın.
- Cihazla uyumlu yazılımda veri toplama işlemini gerçekleştirin.
6. Veri Analizi
- Hedeflenmemiş metabolomik ve lipidomik analize adanmış yazılımı kullanarak veri işleme, varsayılan tanımlama ve istatistiksel analiz gerçekleştirin.
not: Veri yapısını görselleştirmek için temel bileşenler analizi (PCA) ve kutu-bıyık grafikleri elde edilebilir.
