Hücre Dışı DNA Boyama: FFPE Doku Kesitlerinde Hücre Dışı DNA'yı Tanımlamak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: O'Sullivan, K. M. et al. Glomerülonefritte Hücre Dışı DNA'nın Yarı Kantitifikasyonu için Denetimli Makine Öğrenimi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, FFPE doku kesitlerinde hücre dışı DNA'nın boyanması tekniği açıklanmaktadır. Lekelenmiş hücre dışı DNA, kanser hücrelerinin ölümüne yol açan herhangi bir terapötik tedavinin etkinliğini belirlemek için ölçülebilir.

Protokol

1. DAPI ve β-Aktin ile ecDNA için boyama

1. Cam slaytları 60 °C fırında 60 dakika boyunca bir slayt rafına koyun.
2. Slaytları bir çeker ocakta her biri 40 dakika boyunca iki çözücü değişikliğine (ksilen veya ikame) daldırın.
3. Rehidrat, her biri 5 dakika boyunca %100 etanol, %100 etanol ve %70 etanol içinde kayar. Musluk suyunda 5 dakika yıkayın.
4. Çeker ocak içine bir sıcak plaka yerleştirin ve bir düdüklü tencerede antijen alma solüsyonunu (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) önceden kaynatın. Antijen toplama çözeltisi kaynamaya başlar başlamaz, slaytları bir maşa kullanarak tencereye yatay olarak yerleştirin ve kapağı kilitleyin. 10 dakika yüksekte (15 psi veya 103 kPa'ya eşdeğer) kaynatın
   not: Bu adım, epitop antikoruna özgü bağlanmaya izin vermek için antijen epitopunun maskesini (formalin fiksasyonu yoluyla çapraz bağlanmış) açarak ilgilenilen antijeni geri aldığı için çok önemlidir; Sonraki boyama onsuz çalışmayacaktır.
5. Düdüklü tencereyi ocaktan alın ve bir lavaboda kapağın üstüne soğuk musluk açarak kapağı hemen çıkarın. Antijen alma solüsyonunda 20 dakika boyunca dengelenmesi için slaytları bırakın.
6. Slaytları bir orbital çalkalayıcıda 0,01 M fosfat tamponlu salin (PBS) (pH 7.4) içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
7. Böbrek dokusunun etrafına daireler çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın ve bu süre içinde herhangi bir dokunun kurumasına izin vermemeye dikkat edin.
%
8. 5 sığır serum albümini (BSA) / PBS (pH 7.4, 0.01 M) içinde %10 tavuk serumunda dokuyu 30 dakika, bölüm başına 60 μL bloke edin. Bu adımdan sonra yıkamayın, ancak 60 μL'lik bir pipet kullanarak bloke edici solüsyonu dikkatlice çıkarın, bölümlerin kurumasına izin vermeyin.
%
9. 1 BSA / PBS (pH 7.4, 0.01 M), bölüm başına 60 μL'de 1/1000 seyreltilmiş β-aktin için birincil antikor kokteyli uygulayın ve gece boyunca 4 ° C'de bir nem odasında inkübe edin.
10. Slaytları bir orbital çalkalayıcıda PBS'de (pH 7.4, 0.01 M) 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
11. RT'de 40 dakika boyunca% 1 BSA / PBS (pH 7.4, 0.01 M) içinde seyreltilmiş bölüm başına ikincil antikor, tavuk anti-tavşan 488 (1/200), 60 μL uygulayın.
12. Slaytları bir orbital çalkalayıcıda PBS'de (pH 7.4, 0.01 M) 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
13. Slaytları bir Coplin kavanozunda 30 dakika boyunca %70 etanol içinde %0,3 Sudan Siyahı içine daldırın.
    not: Bu adım, formalin fiksasyonunun neden olduğu otofloresanı söndürdüğü için önemlidir.
14. Çökeltiyi çıkarmak için slaytları musluk suyunda yıkayın ve ardından daha fazla Sudan Siyahı çökeltisinin oluşmasını önlemek için 10 dakika PBS'ye (pH 7.4, 0.01 M) daldırın.
15. DAPI ile üç adet 60 μL'lik montaj solüsyonu kullanarak slaytları konfokal cam lamellere monte edin ve lamellerin çevresine uygulayarak lamellerin oje ile kapatın.
16. Slaytların RT'de 24 saat kürlenmesine izin verin (DAPI'nin nüfuz etmesine izin vermek için) ve ardından ışıktan koruyarak 4 ° C'de saklayın.
    not: Floresan probların solmasını önlemek için karanlıkta tutmak önemlidir.
17. Görüntü, bir mikroskoba bağlı konfokal bir lazer tarama kafası kullanılarak kayar. DAPI için 405 lazer ve Beta Aktin için 488 Lazer ile slaytları heyecanlandırın. ecDNA'yı algılamak için gerekli olan satır sıralı yakalama ve 4 satırlı ortalamayı kullanarak tek düzlemli 1024 x 1024 piksel görüntüler yakalayın. 40x 1.0 NA yağ objektifi kullanılmıştır.
    1. Örnek başına en az 20 glomerül görüntüleyin. Görüntüleri ND2 dosyaları olarak kaydedin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sığır Serumu Albümini	Sigma	A2153	% 5 ve% 1'lik çözeltiler PBS'de yapılır, toplu olarak yapılabilir ve dondurulabilir - çözüldükten sonra atın
Tavuk anti Keçi IgG (H + L) çapraz emilen antikor Alexa Fluor 594	ThermoFisher Bilimsel	A-21468	Antikor kokteylinizde herhangi bir serbest konjugattan kaçınmak için kullanmadan önce mini santrifüjde 1 dakika döndürün
Tavuk anti fare IgG (H + L) çapraz emilen antikor, Alex Fluor 647	ThermoFisher Bilimsel	A-121468	Antikor kokteylinizde herhangi bir serbest konjugattan kaçınmak için kullanmadan önce mini santrifüjde 1 dakika döndürün
Tavuk anti tavşan IgG (H + L) çapraz emilen antikor Alexa Fluor 488	ThermoFisher Bilimsel	A-21441	Antikor kokteylinizde herhangi bir serbest konjugattan kaçınmak için kullanmadan önce mini santrifüjde 1 dakika döndürün
Tavuk serası	Sigma	C5405	%1 BSA/PBS'den oluşur
Lamel 24x60 mm	Azerbilimsel	ES0107222	#1.5 Bu, konfokal mikroskopide kullanılmak üzere tasarlanmış standart kalınlık değildir
EDTA 10 milyon	Sigma	E6758	TRIS ve EDTA'yı damıtılmış suda ve pH'ı 9'a ekleyin, antijen alımı için 10x'lik bir Çözelti içinde yapılabilir
Etanol %30, %70 ve %100	Kimyasal Tedarik	UN1170	%100 denatüre edilmemiş etanol olarak tedarik edilir - damıtılmış su kullanarak %30 ve %70'e seyreltin
Formaldehit, %4 (%10 Nötr tamponlu Formalin)	Trajan	NBF-500	Böbrek, RT'de 16 saat boyunca 3 ml formalin içeren 5 ml'lik bir tüpe konur, formalin bir davlumbazda kullanılmalıdır
Cam histoloji slaytları - Ultra Süper Don, Menzel Sır, 25x75 x1.0mm	Trajan	J3800AM4	Pozitif yüklü kaplamalı slaytların kullanılması esastır. Antijen alma aşaması sırasında doku slaytlardan yerinden çıktığı için slaytları kaplamak için poli-L-lizin kullanılmasını önermiyoruz
Keçi anti insan / fare MPO antikoru	AR-GE	AF3667	Aliquot ve varışta eksi 80 derecede dondurun
Hidrofobik kalem	VEKTÖR Laboratuvarları	H-400	Böbrek dokusunun etrafına daire çizmek için kullanın
Fosfat Tamponlu Tuzlu	Sigma	P38135 Serisi	0.01M PB /% 0.09 NaCl Bir seferde 5L oluşturur
Düdüklü Tencere 6L Tefal secure 5 Neo paslanmaz	Tefal	GSA-P2530738	Yerel ev eşyaları mağazasından satın alındı
Altın DAPI'yi Uzatın	Yaşam Teknolojileri	P36962 Serisi	Damlaları doğrudan lamel üzerine uygulayın
Tavşan anti insan/fare Beta Aktin antikoru	ABCAM (ABCAM)	AB8227	Aliquot ve varışta eksi 80 derecede dondurun
Tavşan anti insan/fare H3Cit antikoru	ABCAM (ABCAM)	AB5103	Aliquot ve varışta eksi 80 derecede dondurun
Boyama rafı 24 slayt	ProScitech	H4465	Seçilen boyama rafı, basınç altında kaynamaya ve 60 derecelik fırında inkübasyona dayanabilmelidir
Sudan Siyah B	Sigma	199664	% 0.3% 70 etanol içinde 1 L'lik bir şişeye 3g ekleyin, süzün ve oda sıcaklığında 6 ay boyunca ışıktan koruyun - kararlı
Tris 10mM	Sigma	T4661	TRIS ve EDTA'yı damıtılmış suda ve antijen alımı için pH'ı 9'a ekleyin, 10x'lik bir çözeltide yapılabilir
Ksilen	Trajan	XL005/20	Çeker ocakta kullanılmalıdır