Yöntem makalesi

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Böbrek Podositlerinin Türetilmesi: Olgun Böbrek Podositlerinin Kök Hücrelerden Yönlendirilmiş Farklılaşması İçin Bir Prosedür

2.9K görüntüleme

30 Nisan 2023

Bu makalede

Özet

Kaynak: Burt, M. et al. Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Olgun Böbrek Podositlerinin Rehberli Farklılaşması. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, tanımlanmış kimyasal koşullar altında hücre farklılaşması yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden insan böbrek podositlerini türetme protokolünü açıklıyoruz. Üretilen podositler, nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için kullanılabilir.

Protokol

1. Reaktiflerin Hazırlanması

  1. 1x hiPS CCM çözeltisi elde etmek için çözülmüş 5x hiPS hücre kültürü ortamı (CCM) takviyesini hiPS hücre kültürü bazal ortamında seyreltin.
    not: Dondurulmuş 5x hiPS CCM takviyesi, ideal olarak gece boyunca 4 °C'de yavaş bir çözdürme işlemi gerektirir. 1x hiPS CCM'nin içerikleri -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
  2. HiPS hücre kültürü için bazal membran (BM) matris 1 kaplı plakaların hazırlanması: BM matris 1'i gece boyunca 4 °C'de buz üzerinde çözdürün. Çözüldükten sonra, üreticinin önerdiği şekilde uygun seyreltme faktörlerine sahip alikotları hazırlayın.
    not:

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre
DU11 insan iPS hücreleriDU11 (Duke Üniversitesi klonu # 11) iPS hücre hattı, Duke Üniversitesi iPSC Çekirdek Tesisinde üretildi ve bize Duke Üniversitesi'ndeki Bursac Laboratuvarı tarafından sağlandı. Bu çizgi mikoplazma için test edildi ve en son Temmuz 2019'da laboratuvarımız tarafından karyotiplendi ve karyotipik olarak normal olduğu bulundu.
Büyüme Faktörleri ve Medya Takviyeleri
All-trans retinoik asit (500 mg)72262Kök Hücre Teknolojileri
B27 serumsuz takviye edici gıda17504044Termo/Yaşam Teknolojileri
CHIR9902104-0004KökPartiden partiye değişiklik gösterebilir
Komple Orta Boy Kit
Kültür Artışı-R
4Z0-500-RHücre SistemleriPodosit bakım ortamı
DMEM/F1212634028Termo/Yaşam Teknolojileri
GlutaMAX takviyesi ile DMEM/F1210565042Termo/Yaşam TeknolojileriGlutamin takviyesi ile DMEM / F12
Isı ile etkisiz hale getirilmiş FBS10082147Termo/Yaşam Teknolojileri
İnsan aktivin APHC9564Termo/Yaşam Teknolojileri
İnsan BMP7PHC9544Termo/Yaşam Teknolojileri
İnsan VEGFPHC9394Termo/Yaşam Teknolojileri
mTeSR1 ortamı05850Kök Hücre TeknolojilerihiPS hücre kültürü ortamı (CCM)
Penisilin-streptomisin, sıvı (100×)15140-163Termo/Yaşam Teknolojileri
Y27632 KAYA inhibitörü1254Tocris (Türkçe)
Antikor
Alexa Fluor 488- ve Alexa Fluor 594-konjuge ikincil antikorlarA32744; A32754; A-11076; A32790Termo/Yaşam Teknolojileri
Brachyury(T)AB20680Abcam Belediyesi
NefrinGP-N2Progen (Gen Çiçeği
4 OCT4AF1759Ar-Ge Sistemleri
KİŞİ 271-6000Canlandırıcı
WT1 (İngilizceMAB4234Kırlangıç
ECM Molekülleri
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) parçasıN-892012Iwai Kuzey AmerikaBodrum membranı (BM) matrisi 2
Matrigel hESC nitelikli matris, 5 mL şişe354277BD Biyolojik BilimlerBodrum membranı (BM) matrisi 1. Partiden partiye değişiklik gösterebilir
Enzimler ve Diğer Reaktifler
AktatazA1110501Termo/Yaşam TeknolojileriHücre ayırma çözümü
BsaA9418Sigma-Aldrich
Dimetil Sülfoksit (DMSO)D2438Sigma-AldrichDMSO toksiktir. Kimyasal güvenlik başlığı içinde ele alınmalıdır
Enzim içermeyen hücre ayrışma tamponu, Hank'in dengeli tuzu13150016Termo/Yaşam Teknolojileri
Etanol çözeltisi, %70 (hacim/hacim), biyoteknoloji sınıfı97065-058VWR (VWR)Etanol yanıcı ve zehirlidir
FBS (FBS)431097Corning
Paraformaldehit (PFA)28906Termo/Yaşam TeknolojileriPFA, eldivenler, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlükler dahil olmak üzere uygun kişisel koruma ekipmanlarına sahip bir kimyasal çeker ocakta kullanılmalıdır. Solumaktan ve cilt ile temasından kaçının.
Fosfat tamponlu salin (PBS)14190-250Termo/Yaşam Teknolojileri
Steril Damıtılmış Su15230162Termo/Yaşam Teknolojileri
Triton X-10097062-208VWR (VWR)
Tripsin-EDTA, %0.0525300-120Termo/Yaşam Teknolojileri
ekipman
Aspirasyon pipetleri, ayrı ayrı sarılmış29442-462Corning
Avanti J-15R SantrifüjB99516Beckman Coulter'ın fotoğrafı.
Konik santrifüj tüpü, 15 mL352097Corning
Konik santrifüj tüpü, 50 mL352098Corning
Kriyo kutuları3395465Termo/Yaşam TeknolojileriDondurulmuş alikotları saklamak için
EVOS M7000AMF7000Termo/Yaşam TeknolojileriSabit ve lekeli iPS hücrelerinin ve türevlerinin görüntülerini elde etmek için kullanılan floresan mikroskop
Hemositometre100503-092VWR (VWR)
Heracell VIOS 160i CO2 inkübatörü51030403Termo/Yaşam TeknolojileriiPS hücrelerinin ve türevlerinin rutin kültürü ve bakımı için
AxioCam 503 kamera ile donatılmış ters Zeiss Axio Observer491916-0001-000(mikroskop) ;
426558-0000-000(Kamera)
Carl Zeiss MikroskobuPodosit farklılaşmasının her aşamasında canlı iPS hücrelerinin ve türevlerinin faz kontrast görüntülerini elde etmek için kullanılır
Kimberly-Clark nitril eldivenler40101-346VWR (VWR)
Kimwipes, büyük21905-049VWR (VWR)
Kimwipes, küçük21905-026VWR (VWR)
P10 hassas bariyerli pipet uçlarıP1096-FRDenville Bilimsel
P100 bariyerli pipet uçlarıP1125 SerisiDenville Bilimsel
P1000 bariyerli pipet uçlarıP1126 SerisiDenville Bilimsel
P20 bariyerli pipet uçlarıP1121 SerisiDenville Bilimsel
P200 bariyerli pipet uçlarıP1122 SerisiDenville Bilimsel
Serolojik pipet, 10 mL, ayrı ayrı sarılmış356551Corning
Serolojik pipet, 25 mL, ayrı ayrı sarılmış356525Corning
Serolojik pipet, 5 mL, ayrı ayrı sarılmış356543Corning
Steriflip, 0.22 μm, PESSCGP00525EMD Kırlangıç
Steril Mikrosantrifüj Tüpleri1138W14Thomas BilimselBüyüme faktörlerini ayırmak için
Doku kültürü ile tedavi edilmiş 12 oyuklu plakalar353043Corning
Doku kültürü ile tedavi edilmiş 6 oyuklu plakalar353046Corning
VWR beyaz techuni laboratuvar önlüğü10141-342VWR (VWR)
Geniş eğimli hücre kaldırıcı3008Corning
Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi arası ) Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi arası Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi adet

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mezoderm nd ksiyonuBazal Matriks KaplamaAra MezodermPodosit nd ksiyon BesiyeriH cre DiferansiyasyonuTripsinle zmeSantrif jle PeletlemeK lt r Plakas nk basyonu

İlgili makaleler