İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Böbrek Podositlerinin Türetilmesi: Olgun Böbrek Podositlerinin Kök Hücrelerden Yönlendirilmiş Farklılaşması İçin Bir Prosedür

1. Reaktiflerin Hazırlanması

1. 1x hiPS CCM çözeltisi elde etmek için çözülmüş 5x hiPS hücre kültürü ortamı (CCM) takviyesini hiPS hücre kültürü bazal ortamında seyreltin.
   not: Dondurulmuş 5x hiPS CCM takviyesi, ideal olarak gece boyunca 4 °C'de yavaş bir çözdürme işlemi gerektirir. 1x hiPS CCM'nin içerikleri -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
2. HiPS hücre kültürü için bazal membran (BM) matris 1 kaplı plakaların hazırlanması: BM matris 1'i gece boyunca 4 °C'de buz üzerinde çözdürün. Çözüldükten sonra, üreticinin önerdiği şekilde uygun seyreltme faktörlerine sahip alikotları hazırlayın.
   not: Tipik olarak, alikotlar, 50 mL'lik bir konik tüpte 25 mL soğuk DMEM/F12 içinde müteakip seyreltme için hazırlanır, ardından BM matrisi 1'i tamamen çözmek ve artık kristallerin oluşumunu önlemek için iyice karıştırılır.
3. 1 mL BM matris 1 çözeltisini 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın ve 37 ° C'de 1-2 saat veya 4 ° C'de en az 24 saat inkübe edin, parafin filme sarın. BM matrix 1 kaplı plakalar 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
4. Temel membran (BM) matris 2 kaplı plakaların hazırlanması: 5 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon hazırlamak için uygun miktarlarda BM matris 2'yi 9 mL steril damıtılmış su içinde seyreltin. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 700 μL BM matris 2 çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
5. BMP7, Activin A ve VEGF'nin her biri için 100 μg/mL stok çözeltilerini aşağıdaki gibi hazırlayın: BMP7'yi %0,1 (ağırlık/hacim) BSA içeren steril damıtılmış suda sulandırın ve Activin A ve VEGF'yi %0,1 (ağırlıkça/hacim) BSA içeren steril PBS'de ayrı ayrı sulandırın. Sık donma-çözülme döngülerini önlemek için, her stok çözeltisinden 100 μL alikot hazırlayın ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
6. 10 mg Y27632'yi 3.079 mL steril damıtılmış su içinde çözerek 10 mM'lik bir Y27632 stok çözeltisi hazırlayın. Stoktan 100 μL alın ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
7. 30 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 2 mg CHIR99021'yi 143.4 μL steril DMSO'da çözün. 5 μL'lik alikot hazırlayın ve -20 °C'de 1 aya kadar saklayın (veya üreticinin tavsiyesine göre).
8. 10 mg all-trans retinoik asidi 3.33 mL steril DMSO'da çözün. 500 μL'lik alikotlar hazırlayın ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.

2. Kültür Ortamlarının Hazırlanması

1. Glutamin takviyesi ile uygun bir DMEM/12 hacminde 100 ng/mL Aktivin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 ve 1x B27 serumsuz takviye nihai konsantrasyonuna karşılık gelen stok çözeltilerini sulandırarak mezoderm farklılaşma ortamını hazırlayın.
   not: Mezoderm farklılaşma ortamı, farklılaşma adımlarından önce ve deneyin ölçeğine uygun bir hacimde taze olarak hazırlanmalıdır (tipik olarak, iki adet 12 oyuklu plaka için 50 mL ortam yeterlidir).
2. Bir glutamin takviyesi ile DMEM / F12'de 100 ng / mL BMP7, 3 μM CHIR99021 ve 1x B27 serum içermeyen takviyesi nihai konsantrasyonuna karşılık gelen stok çözeltilerini yeniden oluşturarak ara mezoderm farklılaşma ortamı hazırlayın.
   not: Gerekirse, besiyeri %1 (hacim/hacim) Penisilin-Streptomisin ile desteklenebilir. Glutamin takviyesi ile DMEM/F12 kullanarak ortamın hacmini ayarlayın. Bu ortam büyük partiler halinde hazırlanabilir; bununla birlikte, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için daha küçük alikotlarda (örneğin, 50 mL konik tüplerde 45 mL) saklanması önerilir. Bu ortam -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir ve kullanımdan önce gece boyunca 4 °C'de çözülebilir.
3. Podosit indüksiyon ortamını, 100 ng / mL BMP7, 100 ng / mL aktivin A, 50 ng / mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumsuz takviye ve 0.1 μM all-trans retinoik asit nihai konsantrasyona yeniden oluşturarak hazırlayın glutamin takviyesi ile DMEM / F12'de. Ortamı ışıktan koruyun (örneğin, kabı folyo kağıtla sararak).
   not: Bu besiyeri büyük partiler halinde hazırlanabilir ve karanlıkta -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir. Dondurulmuş alikotlar kullanımdan önce gece boyunca 4 °C'de çözülmelidir.
4. DMEM / F12'de% 10 (hacim / hacim) ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ekleyerek 25 mL tripsin nötralize edici çözelti hazırlayın ve steril koşullar altında süzün.
5. Kök hücre türevi podositlerin farklılaşma sonrası bakımı için, üreticinin yönergelerine göre bazal ortama takviye ekleyerek podosit bakım ortamı ile Complete Medium'u hazırlayın ve iki haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.

3. hiPS Hücre Kültürü Ortamını Kullanarak Besleyicisiz hiPS Hücre Kültürü

1. BM matris 1'in kalıntı çözeltisini önceden kaplanmış plakalardan aspire edin ve kuyucukları 1 ila 2 mL ısıtılmış DMEM / F12 ile 3 kez yıkayın.
2. hiPS hücrelerinden harcanan hiPS CCM'yi aspire edin ve hücreleri ısıtılmış DMEM / F12 ile 3 kez durulayın. 1 mL ılık hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücrelerin ayrışmasına yardımcı olmak için 37 ° C'de 1 dakika inkübe edin. Bir doku kültürü mikroskobu altında hücrelerin görsel incelemesini yapın ve hücre kolonilerinin kenarlarının yuvarlak göründüğünden emin olun, ardından hücre ayırma solüsyonunu hücrelerden hızlı bir şekilde aspire edin (hücre kolonilerinin gevşek de olsa plakaya hala bağlı olduğundan emin olun). Hücre ayırma solüsyonunu çıkarmak için hücreleri DMEM / F12 ile bir kez nazikçe durulayın.
3. Hücre ayırma çözeltisi ile muamele edilen hiPS hücrelerine (6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda) 3 mL hiPS CCM ekleyin. Bir hücre kaldırıcı kullanarak kolonileri kazıyın ve gevşek bir şekilde yapışmış hücreleri çıkarmak için hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için plakayı iyice yıkayın.
   not: Hücrelerde aşırı kaymayı önlemek için 5 mL'lik bir pipet kullanılması önerilir.
4. Hücre süspansiyonunun 0.5 mL'sini, kuyucuk başına 2 mL CCM içeren yeni bir BM matrisi 1 kaplı 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna aktarın. Hücre kolonilerini kuyucuklar içinde dağıtmak için plakayı şekil sekiz şeklinde hareket ettirin ve %5'lik bir CO₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Hücreler geçişe veya farklılaşma deneyi için kullanılmaya hazır olana kadar (yaklaşık% 70 birleşme) ortamı her gün yenileyin.
   not: iPSC'lerin rutin geçişi için ideal koloni boyutu, hiPS CCM (ROCK inhibitörü olmadan) kullanılarak besleyicisiz koşullar altında 200-500 μm arasındadır. Hücreler, ayrışma enzimleri veya tamponları ile tedavi sırasında bireyselleştirilirse, hiPS CCM, hücre canlılığını artırmak için ROCK inhibitörü (örneğin, 10 μM Y27632) ile desteklenebilir.

4. hiPS Hücrelerinin Mezoderm Hücrelerine Farklılaşması (0-2. Günler)

1. HiPS hücre kültürleri üstel büyüme aşamasındayken (geçtikten yaklaşık 4 gün sonra ve yaklaşık %70 birleşme), kolonilerin kenarları içinde ve çevresinde kendiliğinden farklılaşmış hücrelerin varlığını görsel olarak inceleyin. Gerekirse, farklılaşma alanlarını aseptik olarak kazıyın.
2. hiPS hücrelerinden hiPS CCM'yi aspire edin ve hücreleri ılık DMEM/F12 ile 3 kez durulayın. Hücreleri 1 mL enzim içermeyen hücre ayrışma tamponu ile 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin ve mikroskop altında ayrışmayı kontrol edin. Farklı hiPS hücre hatları arasındaki doğal farklılıklar nedeniyle, hücre ayrışma tamponu için gerçek inkübasyon süresi, belirli bir hücre hattı için belirlenmelidir.
3. Gevşek bir şekilde yapışmış hücreleri çıkarmak için kuyuyu bir hücre kaldırıcı ile nazikçe kazıyın ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın, ardından hiPS hücrelerini kişiselleştirmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
   1. Ilık DMEM / F12 ile hücre süspansiyonunu 15 mL hacme getirin ve oda sıcaklığında 290 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   2. Süpernatanı nazikçe aspire edin ve artık BM matrisi 1 ve ayrışma tamponu bileşenlerini çıkarmak için başka bir santrifüjleme turu için hücreleri ılık DMEM / F12 ile yeniden süspanse edin.
4. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri yukarıda tarif edildiği gibi 1 mL mezoderm indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin. 1 x 10⁵ hücre / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için gerekli olan uygun mezoderm farklılaşma ortamı hacmini belirlemek için bir hemositometre veya sürgü sayacı kullanarak toplam hücre sayısını sayın.
5. ECM solüsyonunu BM matrix 2 kaplı plakalardan aspire edin ve plakaları ılık DMEM/F12 ile iki kez durulayın. hiPS hücre süspansiyonunu birkaç kez pipetleyerek nazikçe karıştırın. 1 mL hücre süspansiyonunu BM matrisi 2 kaplı 12 oyuklu plakaların her bir oyuğuna aktarın ve ardından hücreleri daha eşit bir şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın.
6. Plakayı 37 °C'de% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün mezoderm indüksiyon ortamını yenileyin.
   not: 2 gün sonra, hiPS hücresinden türetilen mezoderm hücreleri, ara mezoderm indüksiyonu için hazır olacaktır.

5. hiPS Hücresinden Elde Edilen Mezoderm Hücrelerinin Orta Mezoderme Farklılaşması (2-16. Günler)

1. Farklılaşma protokolünün 2. gününde, mezoderm indüksiyon ortamını aspire edin ve kuyu ara mezoderm indüksiyon ortamı başına 1 mL ile doldurun.
2. Metabolik olarak aktif hücreler için doğru bir büyüme faktörleri ve küçük moleküller eşiğini korumak için ortamı her gün yenileyin. Önemli hücre büyümesi ve ortam besin maddelerinin hızlı bir şekilde tükenmesi varsa (ortamın sararması ile gösterilir), ara mezoderm farklılaşma ortamının hacmi, 12 oyuklu plakaların oyuğu başına 1.3 mL'ye yükseltilebilir.
3. Ara mezoderm hücreleri elde etmek için hücreleri 14 gün daha kültürleyin. 16. günde, bu hücreler daha sonra kullanılmak üzere dondurularak saklanabilir.

6. hiPS Hücresinden Elde Edilen Orta Mezoderm Hücrelerinin Podositlere Farklılaşması (16-21. Günler)

1. Ara mezoderm hücrelerini ılık DMEM / F12 ile durulayın, ardından hücrelerin 37 ° C'de 3 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA oyukları başına 0.5 mL ile inkübe edilmesini izleyin. Hücrelerin ayrışmaya başladığından emin olmak için görsel inceleme yapın.
2. Bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve kişiselleştirilmiş (veya küçük kümeler) hücreler elde etmek için 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak hücre süspansiyonunu birkaç kez pipetleyin.
   not: Bu aşamada, hücrelerin tamamen ayrıştığından emin olun, çünkü toplanmış hücreler protokolün zaman çizelgesi içinde terminal olarak farklılaşmış bir fenotip elde edemeyebilir.
3. Tripsin aktivitesini durdurmak için tripsin nötralize edici çözelti kuyusu başına yaklaşık 2 mL ekleyin.
4. Hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve DMEM / F12 kullanarak hacmi 50 mL'ye getirin ve ardından hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 201 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı aspire edin ve podosit indüksiyon ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin. En iyi sonuçlar için, 12 oyuklu bir plakanın yaklaşık 100.000 hücresi / kuyusu kadar bir nihai tohumlama yoğunluğu sağlayın. Hücre süspansiyonunu BM matris 2 kaplı plakalara ekleyin ve hücrelerin daha eşit bir şekilde dağılmasına yardımcı olmak için plakayı hafifçe sallayın.
6. Hücreleri 37 ° C ve% 5 CO_2'de inkübe edin ve 21.
   . güne kadar podosit elde etmek için ortamı 5 güne kadar yenileyin not: Elde edilen hiPS hücresinden türetilen podositler, podosit bakım ortamı ile tam ortam kullanılarak 2-4 hafta daha kültürde tutulabilir. Podosit bakım ortamına girdikten sonra, hücreler her gün beslenebilir ve sonraki çalışmalar veya aşağı akış analizleri için kullanılabilir.