Detrusor Düz Kas Hücresi İzolasyonu: İnsan İdrar Kesesi Örneklerinden DSM Hücreleri Elde Etmek İçin Enzimatik Bir Sindirim Prosedürü

Özet

Kaynak: Malysz, J. et al. 9-fenantrol-duyarlı katyon akımlarının karakterizasyonu için yeni izole edilmiş insan detrusor düz kas hücrelerinin hazırlanması ve kullanılması. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, iki aşamalı sıralı enzimatik tedavi kullanarak insan idrar kesesi örneklerinden detrusor düz kas hücrelerinin izolasyonunu gösteriyoruz.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. DSM Dokularının Diseksiyonu ve Mukozasız DSM Parçalarının Hazırlanması

1. Ameliyathaneden laboratuvara gelen tüm kalınlıktaki idrar kesesi örneğini, soğuk diseksiyon / sindirim solüsyonu ile doldurulmuş sıkıca kapatılmış bir kapta inceleyin (DS bileşimi için Şekil 1 ve Tablo 1).
   not: Numune genellikle laboratuvara gelmeden önce birkaç saatten gece boyunca soğuk DS'de tutulur. Daha uzun depolama için, DS (Tablo 1) 1 mM CaCl₂ ile desteklenir.
2. Yapışmış kalıntıları ve kanı yıkamak için insan tüm kalınlıktaki DSM örneğini (mukoza, DSM ve seroza dahil tüm katmanları içeren) buz gibi soğuk DS ile çıkarın ve durulayın.
3. İdrar kesesi örneğini, mukozası yukarı ve seroza aşağı bakacak şekilde, buz gibi soğuk DS ile doldurulmuş silikon enantiyomer kaplı (Malzeme Tablosu) 150 mm çapında yuvarlak bir tabağa sabitleyin (Şekil 1B).
4. Komşu yağ dokusunu, kan damarlarını, epiteli (ürotelyum) ve muskularis mukozasını mikromakas ve forseps kullanarak keskin bir diseksiyon ile örnekten çıkarın.
5. Birkaç mukoza içermeyen DSM parçası (~2–3 mm uzunluğunda ve 4–6 mm genişliğinde) kesin (Şekil 1C).

2. Yeni İzole Edilmiş Tek DSM Hücreleri Veren DSM Parçalarının Enzimatik Ayrışması

1. 3 ila 6 DSM parçasını, papain ve ditiotreitol (DS-P, Tablo 1) içeren 1 ila 2 mL önceden ısıtılmış (~ 37 ° C) DS içeren bir tüpe yerleştirin ve DSM parçalarını DS-P'de ~ 37 ° C'de 30-45 dakika inkübe edin, tüpü ara sıra hafifçe sallayın (her 10-15 dakikada bir).
   not: Enzimatik işlem için sıcaklığı en iyi şekilde kontrol etmek için, doku parçaları ve enzim çözeltileri içeren tüpler, ya dolaşımdaki ısıtılmış bir su banyosuna (Şekil 1D) ya da yüksek hassasiyetli sıcaklık kontrollü bir çalkalama suyu banyosuna (Şekil 1E) bağlı suyla dolu bir cam doku odasına yerleştirilir.
2. DS-P'yi tüpten çıkarın, DSM parçalarını buz gibi soğuk DS ile kısa bir süre yıkayın, DSM parçalarını tüpün dibinde bırakarak soğuk DS'yi tüpten atın.
3. DSM parçaları ile tüpe 1 ila 2 mL DS içeren kollajenaz tip II (DS-C, Tablo 1) ekleyin; hafifçe karıştırın ve ~ 37 ° C'de 25-40 dakika inkübe edin, tüpü ara sıra hafifçe sallayın (her 10-15 dakikada bir).
4. DS-C'yi atın ve enzimle muamele edilmiş DSM parçalarını buz gibi soğuk DS ile 5-10 kez yıkayın.
5. Son yıkamadan sonra, DS solüsyonunu tüpün içinde bırakın; tek DSM hücrelerini serbest bırakmak için ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti ile birkaç kez hafifçe ezin.
6. Dağılmış DSM hücreleri içeren birkaç damla DS solüsyonunu cam tabanlı bir hazneye veya bir lamel üzerine yerleştirin ve hücrelerin tabana yapışmasını sağlamak için uygulamadan en az 5 dakika sonra mikroskop altında (20x veya 40x objektif kullanarak) kaliteyi görsel olarak inceleyin.
7. Elektrofizyolojik deneyler için hemen yeni izole edilmiş DSM hücrelerini kullanın veya hücreleri DS içeren bir tüpte ~4 °C'de buz üzerinde veya buzdolabında kullanıma kadar saklayın (tipik olarak 8 saate kadar hazırlık için).
   not: Aynı preparat içinde, hücrelerin kalitesi yüksek derecede canlıdan aşırı sindirilmiş, ölü DSM hücrelerine kadar değişir (Şekil 2). Sıralı papain-kollajenaz yöntemi çok yüksek sayıda cansız hücre verdiğinde, preparat atılır ve DSM parçalarının yeni bir sindirimi gerçekleştirilir, ancak inkübasyon aralıkları azalır. Prosedür çok az DSM hücresi ile sonuçlanırsa, DSM parçalarının müteakip sindirimi için inkübasyon aralıkları arttırılır. α-düz kas aktinine karşı pozitif immünoreaktivite, DSM hücrelerinin kimliğini doğrular (Şekil 3).

Çözüm Türü	Kompozisyon (mM cinsinden)
DS (Diseksiyon / Sindirim Solüsyonu)	80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2MgCl2 ve 11 glikoz, pH 7.4'e ayarlanmış (10 M NaOH ile)
DS-P (Papain içeren DS)	1-2 mg/ml papain, 1 mg/ml ditiotreitol ve 1 mg/ml sığır serum albümini içeren DS
DS-C (Kollajenaz içeren DS)	1-2 mg/ml kollajenaz tip II, 1 mg/ml sığır serum albümini, 0 veya 1 mg/ml tripsin inhibitörü ve 100-200 μM Ca2+ içeren DS çözeltisi
P (Pipet)	110 CsOH, 110 aspartik asit, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.05 EGTA ve 30 CsCl, pH CsOH ile 7.2'ye ayarlanmış ve amfoterisin-B (300-500 μg / ml) ile desteklenmiştir
E (Hücre dışı)	10 tetraetilamonyum klorür (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES ve 10 glikoz, NaOH veya CsOH ile 7.3-7.4'e ayarlanmış pH ve 0.002-3 (2-3 mM) nifedipin

Tablo 1: Delikli yama-kelepçe deneylerinde kullanılan diseksiyon/sindirim çözeltisi (DS) ve pipet ve hücre dışı çözeltilerin bileşimleri.

Sonuçlar

Şekil 1: Detrusor düz kas (DSM) parçalarının hazırlanması ile sonuçlanan diseksiyon adımlarının özeti ve enzimatik ayrışma için kullanılan kurulum. Aşağıdakilerin görüntüleri gösterilmektedir: (A) buz gibi DS'de yabancı cerrahi materyal olarak açık mesane ameliyatından sağlanan tam kalınlıkta bir insan idrar kesesi örneği, (B) kısmen diseke edilmiş bi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüp	doğan	352054	Sindirim basamaklarında kullanılan enzimleri içeren DS için tüpler
Analog girdap karıştırıcı	VWR (VWR)	58816-121
Sığır serum albümini	Sigma-Aldrich	A7906	Ds
Kalsiyum klorür	Sigma-Aldrich	C1016	Hücre dışı çözüm ve DS
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889	Hücre içi pipet çözeltisinde kullanılan Ca2+ şelatör
glikoz	Sigma	G8270
Kollajenaz tip 2	Worthington Biyokimya Şirketi	LS004177	DS-C
Sezyum hidroksit hidrat	Sigma-Aldrich	C8518	Hücre içi pipet çözeltisi
CsCl (İngilizce	Sigma-Aldrich	203025	Hücre dışı ve hücre içi çözümler
DL-Ditiyotreitol (DDT)	Sigma-Aldrich	D9779	Papain ile birlikte kullanılan indirgeyici ajanlar
NaOH (NanoOH	Sigma-Aldrich	S8045 Serisi
Nifedipin	Sigma-Aldrich	N7634	L tipi voltaj kapılı Ca2+ kanal engelleyici
Yüzer köpük tüp raf / tutucu	VWR Bilimsel	82017-634	Sıcaklık kontrolü için enzimli tüpleri tutmak için kullanılır
Glutamik asit (Na tuzu)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
Papaz Otu	Worthington Biyokimya Şirketi	LS003126	DS-P
MgCl2 (hekzahidrat)	Sigma-Aldrich	M2670	Hücre dışı ve hücre içi çözümler
Kartal	Balıkçı Bilimsel	BP366-1	Hücre dışı çözüm
NaCl (Doğal)	Sigma-Aldrich	S7653 Serisi	Hücre dışı ve hücre içi çözümler
Metalik olmayan şırınga iğnesi, MicroFil	TEFE	MF-34G-5	Hücre içi pipet çözeltisinin doldurulması
Pasteur pipeti	Balıkçı Markası	13-678-20A	Uçlar kırılır ve ateşle parlatılır ve tek DSM hücrelerini parçalardan ayırmak için enzimatik olarak işlenmiş dokuların titrasyonu için kullanılır
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma-Aldrich	H3375	pH Tamponu
Thermo Scientific Hassas çalkalama su banyosu (model 2870)	Termo Bilimsel	Üretilmiyor	Enzimatik sindirimin sıcaklık kontrolü için su banyosu, doku odası sirkülasyon banyosu kurulumuna alternatif olarak kullanılır
Vinil boru	ColePalmer (Kömür Avcısı)	06405-3	Doku banyosunu sirkülasyondaki su banyosuna bağlamak da dahil olmak üzere çoklu kullanımlar
Su sirkülasyon banyosu, Haake D1 L	Haake Belediyesi	Üretilmiyor	Doku banyosuna bağlı
ZeissAxiovert 40C 10x ve 40x objektifli ters mikroskop	Carl-Zeiss	Üretilmiyor	Yama kelepçeli teçhizat kurulumunun bir parçası

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi ) Gazetesi Gazetesi Serisi ) Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi