Amfoterisin-B Aracılı Delikli Yama-Klemp Analizi: Mesane Hücrelerinde İyonik Akımları İncelemek İçin Elektrofizyolojik Bir Teknik

Abstract

Kaynak: Malysz, J. et al. 9-fenantrol-duyarlı katyon akımlarının karakterizasyonu için yeni izole edilmiş insan detrusor düz kas hücrelerinin hazırlanması ve kullanılması. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, amfoterisin-B aracılı delikli yama-klemp tekniği kullanılarak detrusor düz kas hücrelerindeki geçici reseptör potansiyeli melastatin tip 4 (TRPM4) iyon kanallarından gelen katyonik akımların karakterizasyonunu göstermektedir. Teknik, iyon kanallarının biyofiziksel ve farmakolojik özelliklerinin değerlendirilmesine yardımcı olur.

Protocol

>1. DSM Hücrelerinden Gerilim Kademeli İndüklenen Katyon Akımlarının Amfoterisin-B Delikli Tam Hücre Voltaj Yama-Kelepçe Tekniği Kullanılarak Kaydedilmesi

1. Ters çevrilmiş bir mikroskop tablası üzerinde oturan cam tabanlı bir hazneye 0,25-1 mL hücre süspansiyonu pipetleyin ve hücrelerin cam tabana yapışmasına izin verin.
2. En az 45 dakika inkübasyondan sonra, sindirim solüsyonunu (DS) banyodan çıkarın ve süperfüzyonla E solüsyonu (Tablo 1) ile değiştirin, burada giriş borusu yoluyla yerçekimi destekli çözelti akışı yavaşça DS'yi yeni çözelti ile değiştirirken, bir vakum atık kabına bağlı çıkış borusu hazne çözeltisini çıkarır ve taşmayı önler.
   not: E çözeltisi, K⁺ akımlarını inhibe etmek için tetraetilamonyum (TEA⁺) ve sezyum (Cs⁺) iyonları içerir.
3. Dimetil sülfoksit (DMSO) (10 μL DMSO başına 1 mg) içinde çalışan bir amfoterisin-B stok çözeltisi hazırlayın. Amfoterisin tozunu tamamen çözmek için, sonikat (en az 15 dakika) ve çözeltiyi iyice vorteksleyin.
   not: Bu adım genellikle 10 dakikadan az sürer. 3-4 mg amfoterisin-B'nin 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 30-40 μL DSMO içinde çözülmesi iyi sonuç verir. Daha yüksek miktarlarda amfoterisin-B, daha fazla DSMO çözücüsü gerektirir, bu da tipik olarak tüpte bulunan amfoterisin-B katı parçacıklarının karıştırılması ve eksik çözünmesi için daha uzun bir aralık ile sonuçlanır.
4. 200-500 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için amfoterisin-B'nin stok çözeltisini pipet çözeltisinde (çözelti P, Tablo 1) çözün. Bu adım, pipet çözeltisinde amfoterisin-B çökelti oluşumunun optimum şekilde karıştırılmasını ve önlenmesini sağlamak için adım başına ~ 30 ila 60 dakika boyunca yüksek hızlı bir ayarda (8-10/10) kapsamlı sonikasyon ve girdap gerektirir.
   not: Amfoterisin-B zamanla çökelir ve ışığa duyarlıdır. Amfoterisin-B içeren çalışma pipet çözeltisinin çözünürlüğü kontrol edilir, pipet doldurmadan önce elle karıştırılır ve karanlıkta tutulur.
5. Birden fazla yama elektrodu, ateş cilası elektrot uçları çekin ve (gerekirse) uçları diş mumu ile kaplayın.
6. Bir yama elektrodunun ucunu, elektrodu çözeltiye kısaca batırarak amfoterisin-B içermeyen pipet çözeltisi (çözelti P, Tablo 1) ile doldurun.
7. Elektrodu amfoterisin-B içeren aynı pipet çözeltisiyle doldurun.
8. Elektrodu bir yamaya bağlı bir tutucuya monte edin.amp amplifier kafasıtage.
9. Bir mikromanipülatör kullanarak, elektrotu hücre dışı çözeltinin yüzeyinin hemen altına yerleştirin, böylece elektrotun ucu sadece suya batırılır.
10. Voltaj-clamp modunda, tutma potansiyelini 0 mV'a ayarlayın ve ticari amplifikatör (Malzeme Tablosu) üzerindeki pipet ofset kadranı ile akımı 0 pA'ya ayarlayın.
11. Ticari satın alma yazılımının Membran Testi penceresini/işlevini kullanarak elektrot direncini belirleyin (Malzeme Tablosu). Etkinleştirmek için Tools>Membrane Test>Play'e veya yazılımdaki bir kısayol simgesine tıklayın. Belirlenen elektrot direnci 2 ila 5 MΩ.
    aralığında olmalıdır not: Ticari satın alma yazılımında sağlanan Membran Testi işlevi veya amplifikatör üzerindeki Sızdırmazlık Testi seçeneği, voltaj adımlarını tekrar tekrar uygulayarak elektrot direncini izlemek için kullanılabilir.
12. Elektrodu bir mikromanipülatör ile seçilen bir DSM hücresine doğru ilerletirken elektrot direncini izlemeye devam edin (Şekil 1A).
    not: Canlı bir DSM hücresi olarak kabul edilmek için, hücrenin iğ şeklinde uzun morfoloji, hücre etrafında iyi tanımlanmış bir hale, keskin kenarlar ve yarı kasılma (serpantin) görünüm göstermesi gerekir.
13. Hücre yüzeyine elektrotla dokunduğunuzda - Membran Testi işleviyle ölçülen elektrot direncinde hızlı bir artışla gösterilir - boru aracılığıyla elektrot tutucusuna hafif hızlı negatif basınç uygulayarak bir giga-conta oluşturun. Bu, hücre zarını elektrotun içine çeken elektrotun ucunda oluşan negatif basınçla sonuçlanır ve elektrot ile plazma zarı arasında bir giga-conta veya çok sıkı bir temas oluşumuna yardımcı olur (Şekil 1B).
14. Giga conta oluştuktan sonra, ticari amplifikatördeki hızlı ve yavaş kadranları ayarlayarak pipet kapasitansını telafi edin ve Membran Testi işlevini kullanarak giga-seal kararlılığını (kaçak akım) izleyin.
15. Amfoterisin-B'nin pipetten aşağı yayılması ve esas olarak monovalent katyonlara seçici gözenekler oluşturan plazma zarına yerleştirilmesi için tipik olarak 30-60 dakika zaman tanıyın. Bu adım sırasında, Membran Testi işleviyle giga-contayı izlemeye devam edin. Hücre perforasyonu arttıkça, Membran Testi fonksiyonu ile ölçülen kapasitans geçici akımlarının genliği de artar (sırasıyla hücre perforasyonu göstermeyan ve etkili hücre perforasyonu gösteren Şekil 1B ile Şekil 1C'yi karşılaştırın).
16. Yama perforasyonu optimal olduğunda (tipik olarak 50 MΩ'un altındaki kararlı seri direnç ile değerlendirilir), amplifikatör üzerindeki hücre kapasitansı ve seri direnç için kadranları ayarlayarak kapasitans geçişlerini iptal edin. Seri direnç kompanzasyonu da bu sırada gerçekleştirilebilir (Şekil 1D).
17. Belirtilen protokol tarafından uyarılan kararlı voltaj adımı indüklenen katyon akımları gözlemlendikten sonra, süperfüzyonla test etmek için bir bileşik veya fizyolojik koşul uygulayın ve kontrol, test koşulu ve yıkama (mümkünse) için yanıtları ticari satın alma yazılımı ile kaydedin.
    1. DSM hücrelerini -64 veya -74 mV'de tutmayı ve voltajı 10 mV'luk artışlarla 400 veya 500 ms için -94 ila +96 veya +106 mV'a düşürmeyi ve tutma potansiyeline geri dönmeyi içeren rutin bir voltaj adımı protokolü ile akımları kaydedin.
       not: Membran potansiyel değerleri, 14 mV'luk bir sıvı bağlantı potansiyeli için ayarlanır (P ve E çözeltileri kullanılarak, Tablo 1). Sıvı bağlantı potansiyeli, ticari edinme yazılımında (Malzeme Tablosu) Araçlar>Bağlantı Potansiyelleri'ne tıklanarak ve çözelti iyon bileşenlerinin konsantrasyonları girilerek elde edilir. Mevcut kayıtları elde etmek için bir rampa protokolü de kullanılabilir.
    2. Bir deney sırasında voltaj protokolünü sürekli ~1 dakikalık aralıklarla çalıştırın ve ön ekleme kontrolü, test koşulu ve yıkama için akımları kaydedin

Çözüm Türü	Kompozisyon (mM cinsinden)
DS (Diseksiyon / Sindirim Solüsyonu)	80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2MgCl2 ve 11 glikoz, pH 7.4'e ayarlanmış (10 M NaOH ile)
DS-P (Papain içeren DS)	1-2 mg / ml papain, 1 mg / ml ditiyotreitol ve 1 mg / ml sığır serum albümini içeren DS
DS-C (Kollajenaz içeren DS)	1-2 mg / ml kollajenaz tip II, 1 mg / ml sığır serum albümini, 0 veya 1 mg / ml tripsin inhibitörü ve 100-200 μM Ca2+ içeren DS çözeltisi
P (Pipet)	110 CsOH, 110 aspartik asit, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.05 EGTA ve 30 CsCl, pH CsOH ile 7.2'ye ayarlanmış ve amfoterisin-B (300-500 μg / ml) ile desteklenmiştir
E (Hücre dışı)	10 tetraetilamonyum klorür (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES ve 10 glikoz, NaOH veya CsOH ile 7.3-7.4'e ayarlanmış pH ve 0.002–3 (2-3 mM) nifedipin

Tablo 1: Delikli yama-kelepçe deneylerinde kullanılan diseksiyon/sindirim çözeltisi (DS) ve pipet ve hücre dışı çözeltilerin bileşimleri.

Results

Şekil 1: İnsan DSM hücrelerinin giga-seal oluşumu ve amfoterisin-B perforasyonunda yer alan adımların şematik gösterimi. Gösterilenler, bir amfoterisin-B içeren pipetin ve bir DSM hücresinin uzamsal konumları ve direnci belirleyen voltaj adımlarını (bu örnekte -10 veya -20 mV) değiştirerek ticari edinme yazılımında (Malzeme Tablosu) elde edilen membran testleri için i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüp	doğan	352054	Sindirim basamaklarında kullanılan enzimleri içeren DS için tüpler
Amfoterisin-B	balıkçı	BP928-250	Yama / hücre perforasyonu için kullanılır
Amfoterisin-B	Avrupa Farmakopesi Referans Standartları	5	Yama / hücre perforasyonu için kullanılır
Amfoterisin-B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG	Yama / hücre perforasyonu için kullanılır
Analog girdap karıştırıcı	VWR (VWR)	58816-121
Aspartik asit	Sigma-Aldrich	A9006	Hücre içi pipet çözeltisi
Sığır serum albümini	Sigma-Aldrich	A7906	Ds
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	Hücre dışı çözüm ve DS
Kılcal Cam	Sutter	BF150-110-7.5	Çekilmiş yama elektrotlarının hazırlanması için kılcal
Sezyum hidroksit hidrat	Sigma-Aldrich	C8518	Hücre içi pipet çözeltisi
Clampex ver. 10 yazılımı, veri toplama (Clampex) ve analiz (Clampfit) programlarını içerir	Akson Aletleri / Moleküler Cihazlar	pCLAMP-10	Ticari yazılım ve yama kelepçesi teçhizat kurulumunun bir parçası
CsCl (İngilizce	Sigma-Aldrich	203025	Hücre dışı ve hücre içi çözümler
Diş mumu	Miltex Diş Balmumu Teknolojileri A.Ş.	18058351
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	çözücü
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889	Hücre içi pipet çözeltisinde kullanılan Ca2+ şelatör
Alevli/Kahverengi mikropipet çektirme	Sutter	P-97	Çok ince uçlu elektrotları çekmek için gereklidir
Yüzer köpük tüp raf / tutucu	VWR Bilimsel	82017-634	Sıcaklık kontrolü için enzimli tüpleri tutmak için kullanılır
glikoz	Sigma	G8270
Glutamik asit (Na tuzu)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma-Aldrich	H3375	pH Tamponu
Kartal	Balıkçı Bilimsel	BP366-1	Hücre dışı çözüm
Düşük Gürültülü Veri Toplama Sistemi	Akson Aletleri / Moleküler Cihazlar	Dijital veri 1440A	Yama kelepçeli teçhizat kurulumunun bir parçası
Manyetik karıştırıcı	VWR (VWR)	01-442-684
MgCl2 (hekzahidrat)	Sigma-Aldrich	M2670	Hücre dışı ve hücre içi çözümler
MicroForge (Mikro Forge	Narishige (Narishig)	MF-830	Yangın parlatma elektrotları için kullanılır
NaCl (Doğal)	Sigma-Aldrich	S7653 Serisi	Hücre dışı ve hücre içi çözümler
NaOH (NanoOH	Sigma-Aldrich	S8045 Serisi
Nifedipin	Sigma-Aldrich	N7634	L tipi voltaj kapılı Ca2+ kanal engelleyici
Nikon ters çevrilmiş mikroskop, 5x, 10x, 20x ve 40x objektifli T1-SM tablalı TS100	Nikon	Üretilmiyor	Yama kelepçeli teçhizat kurulumunun bir parçası
Metalik olmayan şırınga iğnesi, MicroFil	TEFE	MF-34G-5	Hücre içi pipet çözeltisinin doldurulması
Pasteur pipeti	Balıkçı Markası	13-678-20A	Uçlar kırılır ve ateşle parlatılır ve tek DSM hücrelerini parçalardan ayırmak için enzimatik olarak işlenmiş dokuların titrasyonu için kullanılır
Yama kelepçesi amplifikatörü	Akson Aletleri / Moleküler Cihazlar	Akson Axopatch 200B	Yama kelepçeli teçhizat kurulumunun bir parçası
PC bilgisayar	Dell	Özel yapılandırma	Yama kelepçeli teçhizat kurulumunun bir parçası
pH Ölçüm Cihazı	Aspera Aletleri	PH700
Polietilen boru	Intramedik	427-436	Cam tabanlı kayıt odasına bağlı hücre dışı banyonun süperfüzyonu için boru
Tetraetilamonyum klorür	Sigma-Aldrich	T2265	Hücre dışı banyo solüsyonuna eklenen Kv ve BK kanallarının iyon kanal blokeri
Ağırlık ölçeği	Mettler Toledo	XS64
ZeissAxiovert 40C 10x ve 40x objektifli ters mikroskop	Carl-Zeiss	Üretilmiyor	Yama kelepçeli teçhizat kurulumunun bir parçası