Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>NOT: Tedavi edilmemiş, sağlıklı vahşi tip (WT) fareler (n = 4) ve cd44-/- (n = 4) fareler 12-16 haftalıkken sakrifiye edildi. Hem erkek hem de dişi fareler kullanıldı. Tüm fareler C57Bl/6 arka planındaydı.
1. Fare Böbrek Diseksiyonu
- Sağlıklı WT farelerini veya genetik olarak değiştirilmiş fareleri servikal çıkık ile feda edin.
- Fareleri feda ettikten hemen sonra tüm fare böbreklerini inceleyin. Bunun için karın makası kullanarak, cildi ve ardından karın kaslarını keserek medyan laparotomi yapın. Bağırsağı çıkarın ve farenin yanına yerleştirin.
- Böbrekleri bağlantı dokusundan kurtarın ve cerrahi forseps kullanarak böbrek arterini, böbrek damarını ve üreteri makasla keserek böbreği çıkarın.
- Böbreği cerrahi forseps ile tutarak böbrek kapsüllerini böbreklerden çıkarın ve başka bir forseps kullanarak kapsülü çıkarın.
- Böbrekleri, oyuk başına 2 mL Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile hazırlanmış 6 oyuklu bir hücre kültürü plakasına (2 böbrek / kuyu) yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin.
>2. Fare Böbreğinden Glomerül İzolasyonu
- Böbrekleri 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın ve böbrekleri iki neşter kullanarak 1-2 mm'lik küçük parçalar halinde doğrayın. Kıyılmış böbrek parçalarını 1-2 mL HBSS kullanarak ıslak tutun.
- Kıyılmış böbrek parçalarını 300 μm'lik metal bir eleğin üzerine yerleştirin ve 20 mL'lik bir şırınganın pistonunu kullanarak böbreği elekten geçirin. Süzgeci arada HBSS ile tekrar tekrar durulayın ve akışı serolojik bir pipet kullanarak temiz bir Petri kabında toplayın. Ayrıca eleğin alt tarafına kalan/yapışan her şeyi neşter ile kazıyarak toplayın ve toplanan akışa (böbrek homojenatı) aktarın.
- Böbrek homojenatını HBSS ile 75 μm'lik bir elek ile durulayın. Akışı toplayın ve ardından bu akışı 53 μm'lik bir elekten geçirin. Tüm küçük yapıları çıkarmak için her iki eleği de HBSS kullanarak yıkayın.
not: Bu adımda, akış sadece durulanır, ancak 75 μm ve 53 μm elekten preslenmez. Elekler üzerindeki kalıntıları ve daha küçük yapıları temizlemek için HBSS ile yıkama gereklidir. Bu nedenle normalde toplamda 200-300 mL HBSS kullanılır.
- 75 μm ve 53 μm elek üzerinde kalan böbrek yapılarını/materyalini, eleklerin üst yüzeyini %20 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle's besiyeri (DMEM) ile yıkayarak toplayın ve materyali 6 oyuklu ultra düşük bağlantılı bir mikroplakaya aktarın.
not: Elek üst yüzeyini yıkamak için süzgeci eğimli pozisyonda (>45°) durulayın ve böbrek materyalini elek kenarında toplayın. Toplanan materyal, kapsüllenmiş ve dekapsüle edilmiş glomerüller için zenginleştirilir ve sadece birkaç boru şeklinde parça gösterir. Kapsüllenmiş glomerüller çok yapışkandır. Bu nedenle, tek glomerülleri toplamak için, glomerüllerin bir Petri kabının veya kuyu plakasının yüzeyine yapışmasını önlemek önemlidir. Yapışmayı önlemek için, %20 FCS'li orta kullanın ve bu adım için ultra düşük bağlantı plakaları kullanın.
3. Glomerüler Büyümenin Kültürlenmesi
- Ultra düşük bağlantılı mikroplakayı ters çevrilmiş bir ışık mikroskobuna getirin ve 20 μL'lik bir pipet ile tek kapsüllenmiş ve/veya dekapsüle glomerülleri toplayın. Diğer yapıları ve kalıntıları pipetlemekten kaçının. Pipet ucunda tek bir glomerulus topladıktan sonra, aynı pipet ucuna 20 μL'lik bir hacme kadar toplanan böbrek materyali olmadan taze DMEM ortamı ekleyin.
- Tek glomerulusu 20 μL DMEM ortamı ile 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının bir kuyusunun merkezine aktarın ve glomerulusun kuyu merkezine bağlanmasına izin vermek için 37 ° C'de ve% 5 (h / h) CO2'de 3 saat inkübe edin. Glomerulusun kuyu sınırlarına yüzmesini önlemek için plakayı dikkatlice hareket ettirin.
- 3 saatlik inkübasyondan sonra, glomerulus kuyu merkezine bağlanır. Hidrokortizon, insan endotelyal büyüme faktörü, sığır beyni özü ve gentamisin sülfat-amfoterisin B içeren bir büyüme faktörü kiti ile desteklenmiş 500 μL endotelyal bazal ortam (EBM) ve ek olarak %5 (h/v) FBS ve %1 (h/h) penisilin / streptomisin (kalem / strep) her oyuğa dikkatlice ekleyin.
- Tek glomerülleri 6 gün boyunca 37 °C'de kültürleyin,% 5 (h / h) CO2.
NOT: 6 gün içinde parietal epitel hücrelerinden oluşan büyüme oluşur. Spesifik bileşiklerin veya ilaçların parietal epitel hücreleri üzerindeki etkilerini test etmek amaçlanıyorsa, bu 6 günlük süre içinde ortama eklenmelidir.
