$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Tümörün İmplante Edilmesi
>NOT: Her fareye, mesanede 50 μL DMEM boş ortamda 1 x 105 MB49-PSA hücresi implante edilir. Kateterdeki ölü boşluk nedeniyle, her zaman ekstra hacim hazırlayın (fare başına en az 100 μL ekstra). Alternatif bir yaklaşım, hava dolu bir şırınga kullanmak olabilir.
- Hücre
- İmplantasyondan bir gün önce, hücreler yaklaşık% 80 birleştiğinde, MB49-PSA tümör hücrelerini tam DMEM ortamında (% 10 FBS, 2 mmol / L L-glutamin, 0.05 mg / mL Penisilin-Streptomisin ve 200 μg / mL Higromisin B ile desteklenmiş) 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 1: 2'lik bir bölünme oranında geçirin.
- İşlem gününde, hücreleri steril bir hücre kazıyıcı ile nazikçe kazıyarak hasat edin. Eşit hacimlerde hücre süspansiyonu ve% 0.4'lük bir tripan mavisi çözeltisini karıştırın. Bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. Hücrelerin %20'sinden fazlası ölmüşse implant yapmayın.
- Gerekli canlı hücre sayısını hesaplayın (2 x 10,6 hücre/mL) ve bunları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 250 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini DMEM boş ortamda yeniden süspanse edin. İmplantasyondan önce tüm FBS izlerini gidermek için yıkamayı üç kez tekrarlayın.
- Fareler implantasyon için hazır olana kadar hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.
- 4 ila 6 haftalık dişi C57BL / 6J farelerinin işlemden önce bir hafta boyunca iklimlendirmesine izin verin. Steril koşulları korumak için tüm hayvan çalışmaları biyolojik bir güvenlik kabininde yapılmalıdır.
- Her fareyi tartın ve anestezi (75 mg / kg ketamin ve 1 mg / kg medetomidin) 10 g vücut ağırlığı başına 0.1 mL'de intraperitoneal olarak enjekte edin. Vücut ağırlıkları 17 ile 22 g arasında olmalıdır. Ayak parmağınızı sıkıştırdıktan sonra yanıt olmadığını gözlemleyerek anesteziyi onaylayın.
- Tanımlama için, kulağı bir kulak zımbası kullanarak işaretleyin.
- Hidrasyon için her 1-2 saatte bir 10 g vücut ağırlığı başına 0.1 mL'de Hartmann çözeltisini veya bileşik sodyum laktatı intraperitoneal olarak enjekte edin.
- Steril bir pamuk ampul kullanarak her iki göze de steril oftalmik merhem sürün, çünkü anestezi altında yanıp sönme refleksi kaybolur ve gözler kurur. Gerektiğinde tekrar uygulayın.
- Vücut ısısını korumak ve arka ayakları bantlamak için fareleri sırtüstü pozisyonda bir ısı paketinin (hava ile temas ederek aktive edilir) üzerine kağıt havluların üzerine koyun.
- Bir parmağınızla alt karın bölgesine hafif bir baskı uygulayın ve idrarı mesaneden 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Bu örnek, idrar PSA'sının bazal değeri olarak işlev görür.
- Steril poli-L-lizin'i (PLL) 1 mL'lik bir şırıngaya çekin ve iğne stilesi çıkarılmış olarak 24 gauge IV kateter takın. Kateterin ucuna kayganlaştırıcı uygulayın ve kateterizasyonu yönlendirmek için forseps kullanarak kateteri üretradan mesaneye yerleştirin. Direnç hissedildiğinde durun.
NOT: Araştırmacılar, intravezikal damlatmalar için anestezik içeren bir yağlama jeli kullanılması ve işlem sonrası analjeziklerin kullanımı konusunda veteriner personeli ile tartışmalıdır.
- Vezikoüreteral reflüyü önlemek için her 20 saniyede bir 10 μL oranında 50 μL PLL'yi yavaşça dayıltın. Dışarı akışı önlemek için kateteri bir tıpa ile 20 dakika mesanede bırakın.
- 20 dakika sonra, kateteri çıkarın ve alt karın bölgesine hafifçe bastırarak mesaneyi herhangi bir içerikten boşaltın. 1 mL'lik boş bir şırınga kullanarak, kalan içeriği kateterden boşaltın.
- MB49-PSA hücrelerini pipetleyerek iyice karıştırın ve 1 mL'lik bir şırıngaya çekin. Kateteri takın ve kayganlaştırıcı uygulayın. Her 20 saniyede bir 10 μL'lik yavaş bir hızda 50 μL 1 x10 5 hücre aşılayın. Kateter üzerindeki durdurucuyu değiştirin. Kontrol farelerine 50 μL salin verin.
- 1 saat sonra, kateterleri çıkarın ve mesaneyi herhangi bir içerikten boşaltın. Arka ayaklardaki bandı çıkarın ve fareleri ventral taraflarına yerleştirin. Tersine çevirme ilacını (1 mg / kg atipamezol) 10 g vücut ağırlığı başına 0.1 mL'de deri altına enjekte ederek fareleri canlandırın.
- Hareketlilik gözlenene kadar fareleri izleyin. Fareleri kafeslerine geri koyun.