DNA Plazmitlerinin Fare Mesanesinin Urothelium'una Verilmesi: Genetik Olarak Tasarlanmış Modeller Oluşturmak için DNA Plazmitlerini Murin Mesanesinin Ürotelyal Hücrelerine Verimli Bir Şekilde Vermek İçin Elektroporasyon Tabanlı Bir Prosedür

Özet

Kaynak: Chuan, Y. et al. Elektroporasyon yoluyla fare mesane ürotelyumuna plazmit DNA iletiminin yeni yöntemi. J. Vis. Uzm.(2018)

Bu video, üretral kateterizasyon ve elektroporasyon tekniklerinin bir kombinasyonu kullanılarak DNA plazmidinin fare mesanesinin ürotelyumuna verilmesini göstermektedir. Açıklanan prosedür, fare mesane kanseri modellerinin oluşturulmasına izin verir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Plazmid ve Aletlerin Hazırlanması

1. Her mesanenin transfekte etmesi için en az 20 μL DNA plazmidi (1 μg/μL) hazırlayın.
2. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpündeki 20 μL plazmit çözeltisine 1 μL Tripan Mavisi ekleyin. İyice karıştırmak için pipetleyin.
3. Tüm cerrahi aletleri otoklavlayın ve çalışma alanını %70 etanol ile sterilize edin. Steril koşulları korumak için aşağıdaki adımları gerçekleştirirken cerrahi aletlere ve eldivenlere sık sık %70 etanol püskürtün veya bir cam boncuk sterilizatörü kullanın.

2. Plazmid Teslimatı

1. Anestezi uygulanmış fare karnına% 70 etanol uygulayın ve mesanenin üzerindeki karın derisini açmak için 1 cm'lik dikey bir kesi yapmak için bir neşter kullanın.
2. Kateterin dış ucuna en az 20 μL plazmid artı Tripan Mavisi solüsyonu pipetleyin ve şırıngayı takın.
3. Plazmit çözeltisini mesaneye enjekte edin. Mesane maviye dönerse, enjeksiyon başarılı olur. Mesanede hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için kateterde bir miktar sıvı bırakın.
4. Cımbız kullanarak dış üretral deliği tutun ve ardından kateteri ve şırıngayı çıkarın. Dış üretral deliği sıkmak için bir ip kullanın. İp ile iki ilmek yapın ve ardından iki düğümle bağlayın.
   not: Üretralin sıkılaştırılması, plazmit sıvısının geri akışını önlemek için önemlidir.
5. Elektroporasyon jeneratörünü aşağıdaki parametrelerle açın: 33V, 50 ms çalışma süresi ve 950 ms aralık süresi.
6. Mesaneyi cımbızla tutun ve mesaneyi iki elektrotla sıkıştırın. Elektroporasyonu gerçekleştirmek için ayak pedalına basın.
   not: Elektrik darbeleri, her pedala basıldıktan sonra kısa aralıklarla 5 kez gerçekleşecek şekilde ayarlanmıştır. Bu işlem sırasında fare seğirebilir. Ayak pedalına bir kereden fazla basmak dağıtım verimliliğini artırabilir, ancak çok fazla elektrik darbesi ürotelyumun doku bütünlüğüne zarar verebilir.
   1. Cımbız ve elektrotlar arasında herhangi bir temastan kaçının, çünkü bu bir kıvılcım oluşturacaktır.

3. Kurtarma

1. Karın ve cilt deliğini steril cerrahi dikişler ve klipslerle dikin. Yaranın üzerine iyot sürün.
2. Hayvanı izofluran sisteminden çıkarın. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için buprenorfin analjezik (0.1 mg / kg) deri altına uygulayın.
3. Hayvanı ısıtma yastığı üzerinde tutun ve tamamen iyileştikten sonra ev kafesine geri koyun. Hayvanı günde en az bir kez normal hareketlilik, içme ve beslenme davranışları açısından kontrol edin ve kesi iyileşene kadar enfeksiyon belirtisi yok ve ardından klipsleri çıkarın. Hayvan tımarlamada azalma, artan saldırganlık ve seslendirme gibi ağrı semptomları gösteriyorsa, sonraki buprenorfin analjezik enjeksiyonlarını uygulayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BD 1 mL TB Şırınga	balıkçı	148232D
Buprenorfin	Sigma	B9275-50MG
Dumont Cımbız	Roboz Cerrahi Eğitim	RS-5005	Cerrahi kullanımdan önce% 70 etanol ile tedavi edin
ECM830 SQ Dalga Elektroporatörü	Harvard Aygıtı	450052
Exel International Tek Kullanımlık Safelet I.V. Kateterleri	Balıkçı Bilimsel	14-841-21	24G, 2.11 cm uzunluk, 0.045 cm dış çap
Ekstra İnce Mikro Diseksiyon Makası	Roboz Cerrahi Eğitim	RS-5135	Cerrahi kullanımdan önce% 70 etanol ile tedavi edin
İzofluran	Veteriner bir	501017
Küçük hayvanlar için K&H ısıtmalı dinlenme matı, 9 x 12 inç	Amazon		Isı matını kağıt havluyla örtün
Oftalmik merhem	balıkçı	NC0849514
PBS, pH 7.4	Yaşam Teknolojileri	10010049
Pipet uçları 200 μL	ABD Bilimsel	1111-0206
Pipet Uçları, Evrensel Uyum; 0,1 ila 10 μL	balıkçı	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPET MAKINESI NEO P200N	Gilson	F144565
plazmid CAG-GFP	Ekle	16664
Platin cımbız 5 mm	Harvard Aygıtı	450489	5 mm çap
makas	Roboz Cerrahi Eğitim	RS-5880	Cerrahi kullanımdan önce% 70 etanol ile tedavi edin
Dize kordonu	Amazon		Mandala El Sanatları 150D 210D 0.8mm 1mm deri dikiş dikiş düz mumlu iplik dize kordon
Bant, Scotch	balıkçı	19047257
Therio-jel Veteriner Yağlayıcı	PBS hayvan sağlığı	353-736
Tripan Mavi Leke	Yaşam Teknolojileri	15250061
V-1 Masa üstü sistem anestezi	Veteriner Ekipmanları	901806
Vicryl menekşe sütür 18" FS-2 kesme 5-0	balıkçı	NC0578475
Walgreens Povidon İyot %10	Yeşillik	953982
Yara klipsi	balıkçı	18045
Yara klipsi uygulayıcısı	balıkçı	1804