Eksozom İzolasyonu: Kültürlenmiş Hücrelerin Şartlandırılmış Ortamlarından Eksozomları Ayırmak için Sükroz Yastığı Kullanan Yoğunluğa Dayalı Bir Ultrasantrifüjleme Tekniği

Özet

Kaynak: Faruqu, F. N. et al. Kanser Hücrelerine siRNA Verilmesi için Eksozomların Hazırlanması.J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, döteryum oksitte hazırlanan %25 (a/a) sükroz yastığı kullanılarak insan embriyonik böbrek hücre kültürlerinden hasat edilen şartlandırılmış ortamdan eksozomları izole etmek için yoğunluğa dayalı bir ultrasantrifüjleme tekniği açıklanmaktadır. İzole edilmiş eksozomlar, aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

Protokol

1. Sükroz Yastığı Üzerine Eksozom İzolasyonu

1. Hasat edilen şartlandırılmış ortamı (CM) aşağıdaki gibi diferansiyel santrifüjleme ve filtreleme ile önceden temizleyin.
   1. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve peleti atın. Bu santrifüjleme adımını bir kez daha tekrarlayın, süpernatanı geri kazanın ve peleti atın.
   2. Süpernatanı adım 1.1'den itibaren santrifüjleyin. 15 dakika ve 4 ° C boyunca 2.000 x g'de ve ardından peleti atın. Geri kazanılan süpernatanı 0,22 μm filtrelerden bir kez süzün.
2. Ön temizleme sırasında, üniversal bir tüpte 1,9 g (± 0,001 g) sakarozu doğru bir şekilde tartarak ve ardından ağırlık 7,6 g'a (± 0,001 g) ulaşana kadar döteryum oksit ile doldurarak döteryum oksit içinde% 25 (a/a) sükroz çözeltisi hazırlayın.
3. Bir ultrasantrifüj tüpünü (Malzeme Tablosuna bakınız) 22,5 mL önceden temizlenmiş CM ile doldurun. Mevcut hacim bundan daha azsa, CM'yi 0,22 μm filtrelenmiş PBS ile 22,5 mL'ye yükseltin.
4. Tüpe bir cam pipet yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve içinden 3 mL sükroz çözeltisi ekleyin, böylece çözelti CM'nin altında ayrı bir tabaka oluşturur.
5. Katmanlı CM / sükroz çözeltisi içeren tüpü, açılır bir rotorun kovasına dikkatlice yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve kovayı rotora sabitleyin.
6. Rotoru ultrasantrifüje yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 °C'de 1,5 saat boyunca 100.000 x g'da döndürün.
7. Sükroz tabakasının 2 mL'sini toplayın ve bunu bir yıkama aşaması için 20 mL filtrelenmiş PBS içeren bir ultrasantrifüj şişesine (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
8. Tüpleri sabit açılı bir rotora yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 4°C'de 1,5 saat boyunca 100.000 x g'da döndürün.
9. Süpernatanı 10 mL'lik bir serolojik pipetle dikkatlice çıkarın ve peleti 400 μL filtrelenmiş PBS ile yeniden süspanse edin. Bu eksozom stoğunu kısa süreli ve uzun süreli depolama için sırasıyla 4 °C veya -80 °C'de tutun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sakaroz	Balıkçı Bilimsel	S/8600/60 Muhafaza Numarası	1 kg
Döteryum oksit (D2O)	Sigma-Aldrich	151882	250 gr
1X Fosfat Tamponlu Tuzlu	Thermo Fisher Bilimsel	10010015	500 ml
Millex-GP Şırınga Filtre Ünitesi 0.22 μm	Kırlangıç	SLGP033RS
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	Optima XPN-80
Açılır rotor	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	SW45 Ti
Sabit açılı rotor	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	70 Ti yazın
Ultrasantrifüj tüpleri	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	355631	Polikarbonat. doldurma 32 ml
Ultrasantrifüj şişeleri	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	355618	Polikarbonat. Min. doldurma 16 ml, maks. doldurma 25 ml
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5810R
Cam pipetler	Balıkçı Bilimsel	1156-6963
%25 w / w sükroz yastığı			Evrensel bir tüpe 1,9 g (± 0,001 g) sükroz ekleyin ve ağırlık 7,6 g'a (± 0,001 g) ulaşana kadar D2O ile doldurun. Bu, %25 w / w sakaroz yastığının ~ 6 ml'sini yapar.