$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Doku İşleme ve Primer Tübüler Hücre İzolasyonu
- Böbrek kapsüllerini ve medullayı çıkarın, her iki böbreği de küçük parçalara ayırın ve 37 ° C'lik bir fırında 10 mL'lik bir sindirim tamponunda 5 dakika boyunca hafifçe döndürerek inkübe edin.
- Tamponu 70 μm'lik bir filtreden geçirerek sindirilmemiş böbrek dokularını çıkarın. Sindirimi durdurmak için 10 mL kültür ortamı ekleyin.
- Tübüler hücreleri toplamak için, ilk peleti toplamak için filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 50 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve 5 mL kültür ortamı ekleyin, tüm tübüler hücrelerin ikinci pelette toplandığından emin olmak için 5 dakika boyunca 50 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjleme, öncelikle ağır tübülleri peletlemek için daha düşük bir hızdadır. Daha sonra, hücreler izolasyondan kurtulduktan sonra, saf tübüler kültür, alt kültürler sırasında daha yüksek bir hızda santrifüjlenir.
- İlk peleti 20 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin ve üçüncü peleti toplamak için 5 dakika boyunca 50 x g'da santrifüjleyin.
- İkinci ve üçüncü peletleri 1 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL Tripan Mavisi ile karıştırın, karışımı bir sayma slaytının A odasına yükleyin ve hücre canlılığını otomatik hücre sayacından kaydedin.
- Önceden kollajen ile kaplanmış 60 mm'lik tek bir tabağa 107 hücreye (heterojen bir popülasyon) kadar tohumlayın ve boru şeklindeki hücrelerin gece boyunca bağlanmasına izin verin.