$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Periyodik Asit Schiff (PAS) Lekesi
>NOT: PAS boyası, glomerüler kılcal halkaların bazal membranlarını ve tübüler epiteli vurgulayacaktır. Glomerüler hücrelerin, mezanjiyal matrisin ve potansiyel genişlemenin ve GBM'nin potansiyel değişikliklerinin (yani kalınlaşma ve düzensizlikler) ayrıntılı olarak görselleştirilmesini sağlar.
- Parafine gömülü, PFA ile sabitlenmiş böbrek korteksini 5 μm kalınlığında bir mikrotom kullanarak poli-L-lizin kaplı slaytlar üzerine bölümlere ayırın. 37 °C'de 1 saat kurutun. Bölümün, mikroskop altında morfolojiyi bozabilecek herhangi bir kıvrım veya delik içermediğinden emin olun.
- Slaytları, her biri 3 dakika, her biri 3 dakika, %100 EtOH'de iki kez ve her biri 3 dakika ve ardından %95, %70 ve %50 EtOH'de bir kez 3 dakika inkübe ederek slaytları deparafinize edin, hepsi oda sıcaklığında. Slaytları dH2O'da yeniden sulandırın.
- Slaytları periyodik asit çözeltisinde (DİKKAT, tahriş edici; çeker ocakta kullanın) (1 g / dL) 5 dakika inkübe edin ve ardından slaytları birkaç dH2O değişikliğinde durulayın. Oda sıcaklığında 100 mL dH2O içeren bir kap kullanın.
- Slaytları Schiff reaktifinde (Parasoanilin HCl 6 g / L ve sodyum metabisülfit %4 HCl 0.25 mol / L) oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Slaytları akan musluk suyunda 5 dakika yıkayın.
- Slaytları akan musluk suyunda 15 dakika boyunca iyice durulamadan önce 3 saniye boyunca Hematoksilen ile < >
not: Hematoksilen boyama için en uygun zamanı belirlemek için bazı optimizasyonlar gerekebilir.
- Dehidrat, deparafinizasyon protokolünün tersini kullanarak kayar. Ksilen ile bitirin.
- Havayla kuruyan kızaklar ve ksilen bazlı montaj ortamı ile monte edin.
- Glomerüler yapıları değerlendirmek için 400X büyütmede ışık mikroskobunda görüntü. Aşağıdakileri değerlendirin: GBM'nin kalınlaşması ve düzensizlikleri, kılcal halkaların çökmesi, fibrotik doku, skleroz, hücresel proliferasyon (endotelyal, podosit ve mezanjiyal veya tutamın içine sızan enflamatuar hücreler).
not: Glomerüler patofizyolojinin kapsamlı bir değerlendirmesi için, tübüller gibi böbreğin başka yerlerindeki lezyonlar değerlendirilmelidir.