Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hidrodinamik renal pelvis enjeksiyon ameliyatını gerçekleştirin
- Ameliyat için fareleri dikkatlice seçin.
NOT: Gerine özgü farklılıklar henüz gözlenmemiştir, ancak mümkün olabilir. Enjeksiyonların çoğu C57BL / 6 veya FVB arka planlarında olmuştur. Renal pelvis enjeksiyonları 6-12 haftalık farelerde en iyi sonucu verir. 16 haftadan büyük farelerde, belirsiz nedenlerle lusiferaz görüntüleme ile %50'ye kadar başarısızlık oranı mümkündür. Karaciğere hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyonları için de yaşa bağlı aynı başarısızlık oranı gözlenmiştir, bu nedenle bu, hidrodinamik enjeksiyon prensibi ile ilgili genel bir sınırlama olabilir. Aynı doğrultuda, diğerleri fibrotik sıçan karaciğerine hidrodinamik kuyruk veni enjeksiyonunun sağlıklı karaciğer kadar etkili olmadığını göstermiştir, bu nedenle renal fibroz ortamlarında renal pelvis hidrodinamik enjeksiyonunun o kadar etkili olmaması mümkün olabilir, ancak bu doğrudan test edilmemiştir.
2. Fareleri ve DNA Şırıngalarını Ameliyata Hazırlayın
- Fareleri ketamin ve ksilazin ile uyuşturun.
- Tek kullanımlık laboratuvar önlüğü, cerrahi yüz maskesi ve nitril eldiven gibi hayvan tesisinin gerektirdiği doğru kişisel koruyucu ekipmanı giyin.
- Bir seferde 2-4 fare ile çalışarak, her fareyi 500 mL'lik plastik bir beherde 0,1 g'a kadar hassas bir ölçekte tartın. Her fareye intraperitoneal enjeksiyonla uygulamak için normal% 0.9 salin içinde seyreltilmiş 24 mg / mL ketamin ve 2 mg / mL ksilazin miktarını hesaplayın (intraperitoneal enjeksiyon hakkında daha fazla bilgi için referans verilen videoya bakın). (50 μL + ((5 μL) x (ağırlık(g))) formülünü kullanın veya alternatif olarak yerel veteriner ekibi ve IACUC ile görüştükten sonra başka bir formüle göre hesaplayın.
- Fareyi standart tekniklerle intraperitoneal enjeksiyon ile enjekte edin. Fare hareketsiz hale gelene kadar fareyi bir kağıt kovaya koyun.
NOT: Fareler, ayak parmağını sıkıştırma testine artık yanıt vermediklerinde ameliyata hazırdır. İlk enjeksiyondan 20-30 dakika sonra ayak parmağı sıkıştırma testine yanıt vermeye devam eden farelere, yanıtın gücüne bağlı olarak 20-60 μL daha fazla anestezik verin.
- Fareyi mavi bir pedle kaplı su sirkülasyonlu bir ısı yastığına yerleştirin ve korneanın kurumasını önlemek için her iki göze de veteriner merhemi yerleştirin.
- Evcil hayvan bakımı için tasarlanmış bir tıraş makinesi ile farenin sırtının sol tarafını omuzdan kıçına ve böğründen omurgasına kadar tıraş edin. Gevşek saçları ve kalıntıları temizleyin.
- Anestezi uygulanmış her fare için 100 μL seyreltilmiş DNA içeren ayrı bir şırınga hazırlayın ve hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- Steril bir 29G x 1/2" 0.5 mL U-100 insülin şırıngası kullanın, güvenlik olmadan kalıcı olarak takılmış bir iğne ile.
NOT: Şırınga tipi kritik öneme sahiptir. Bu gösterge hızlı bir enjeksiyona izin verir. Kalıcı olarak takılan iğne, solüsyonun dışarı sızmasını önler. Güvenliğin varlığı renal pelvise erişimi engelleyecektir. Malzeme Tablosunda belirtilen şırıngalar, enjeksiyon sırasında test edilen diğer markalardan daha eşit bir şekilde kayar.
- Şırıngayı ~ 120 μL'ye yükleyin ve üstte bir boşluk oluşturmak için pistonu aşağı çekin. Tüm hava kabarcıkları yukarı çıkana kadar bir kalemle hafifçe vurun. İğneyi yukarıda tutarak, iğnenin ucunda bir damlacık oluşana kadar tüm havayı çıkarmak için pistona dikkatlice bastırın. Görünür kabarcıklar olmamalıdır, çünkü bunlar hayvanı öldürecek bir hava embolisine neden olabilir.
- Fazla DNA solüsyonunu orijinal mikrofüj tüpüne boşaltarak şırıngada 100 μL olana kadar pistona bastırmayı bitirin. Gerekirse dikkatlice etiketleyin ve işin yapıldığı tesis iğnelerin tekrar kapatılmasına izin vermiyorsa steriliteyi korumak için yüklenen şırıngaları steril bir örtü üzerine yerleştirin.
>3. Enjeksiyon Ameliyatı Yapın
- Bölgeyi ameliyat için hazırlayın. Isı yastığının üzerine steril bir örtü yerleştirin ve steril cerrahi aletleri dokunmadan steril örtünün üzerine boşaltın. Fareyi kaldırın ve görüş alanına yerleştirin. Alanı aydınlatmak için aydınlatmayı ayarlayın.
- Üç adet %3.15 klorheksidin glukonat ve %70 izopropil alkol deri antiseptik bezini paketlerden çıkarın ve hayvanın yanına yerleştirin.
- Steril cerrahi eldivenlere geçin. Kesi bölgesinden başlayarak dairesel bir hareketle çalışarak, hayvanı üç kez yeni bir klorheksidin / alkollü çubukla sürün.
- Şekil 1A'da gösterildiği gibi kesi bölgesini bulun. Cildi cımbızla sıkıştırarak, omurgadan yaklaşık 1 cm uzakta ve göğüs kafesinin altındaki cilt tabakasına bir kesi yapmak için makas kullanın. Kesilen bölge yaklaşık 1 cm uzunluğunda olduğunda, aşağıda kas tabakasında benzer bir kesim yeri yapın.
NOT: Böbreğin kesiden zar zor geçmesine ve daha sonra kesiğin kendisi tarafından yerinde tutulmasına izin vermek için kesiği doğru uzunlukta yapın. Çok küçük bir kesi ve böbrek açığa çıkarılamaz; çok büyük ve böbrek sürekli olarak karın boşluğuna geri kayar.
- Böbreği bulun.
not: Beyaz yağ dokusu arasında görülebilir. Dalak ayrıca hayvanın sol tarafında bulunur. Bu organların rengi görsel olarak ayırt edilebilir, çünkü dalak koyu kestane rengi, böbrek ise koyu kırmızı-turuncu renktedir. Dalağın manipüle edilmesi arzu edilmez, çünkü kolayca yırtılabilir.
- Böbreğe dokunmadan, parmaklarınızla karın bölgesine sabit, hafif bir baskı uygulayarak karın boşluğundan nazikçe açığa çıkarın (Şekil 2C). Gerekirse istenmeyen organları nazikçe karın içine geri itmek için kapalı cımbız kullanın. Böbreğe veya diğer organlara zarar verebileceğinden açık forseps kullanmayın.
- Böbrek karın dışına çıktıktan sonra, küçük beyaz bir nokta olan renal pelvisi görselleştirmeye yetecek kadar çevredeki yağdan nazikçe ayırın (Şekil 1B). Fazla yağı bir tarafa itin veya gerekirse çıkarın. Böbreğin üst kutbunun yakınında bulunan adrenal bezi veya böbrek kapsülünü çıkarmadığınızdan emin olun.
- Kapalı forseps kullanarak renal pelvis görünecek şekilde böbreğin sağ tarafından aşağı doğru itin, yüklü insülin şırıngasını sağ elinizle kavrayın ve iğne renal pelvise doğrultulmuş şekilde çalışma yüzeyine paralel tutun (Şekil 2E). İğneyi, Şekil 1B'de gösterildiği gibi hareketsiz hale getirilmiş böbreğin renal pelvisine dikkatlice yerleştirin.
- Solüsyonu üç saniye içinde hızlı bir şekilde enjekte edin. Böbreğin yaklaşık üçte biri berraklaşabilir ve rengi beyaza dönüşebilir.
NOT: Enjeksiyonu takiben böbrek kapsülünde sıvı birikmesinin yanı sıra hematom oluşumunu gözlemlemek yaygındır. Tespit için yeterli düzeyde DNA transfeksiyonu elde etmek için bir miktar hasar gereklidir.
- Çözeltinin geri akışını önlemek için iğneyi yaklaşık 10 saniye yerinde tutun. Sonra iğneyi dikkatlice ve yavaşça çıkarın. Kesi bölgesini nazikçe gererek ve kapalı forseps kullanarak organı karın boşluğuna geri koyun.
- Hayvanın kas tabakasını 5-0 emilebilir sütürle dikin, 2-4 bağımsız düğüm yerleştirin.
- Hayvanın deri tabakasını 5-0 veya 6-0 emilmeyen naylon dikişlerle 2-4 bağımsız düğüm yerleştirerek dikin.
NOT: Cerrahi aletler steril bir boncuk banyosuna yerleştirildikten ve soğutulduktan sonra tekrar kullanılabilir.
