$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hücrelerin İmplantasyonu
Renca hücrelerini intrarenal olarak implante etmek için, Renca hücrelerini Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinde (HBSS) 2 x 106 hücre / mL'de tek hücreli bir süspansiyona hazırlayın.
- HBSS'de% 0.25 tripsin kullanarak doku kültürü şişesinden yapışkan Renca hücrelerini çıkarın. ~ 5 dakika sonra, tripsini nötralize etmek ve hücreleri yıkamak için bir santrifüj tüpüne aktarmak için şişeye tam RPMI ekleyin. Hücreleri 25 ° C'de 5 dakika boyunca 300 bağıl merkezkaç g kuvvetinde (rcf x g) santrifüjleyin.
- Süpernatanı boşaltın ve HBSS'deki hücreleri yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 2 x 106 hücre / mL elde etmek için HBSS ile hacmi ayarlayın.
- Hücreler üzerinde kayma stresini önlemek için hücreleri 18 gauge iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırıngaya çekin. Tümör hücrelerinin enjeksiyonundan önce 18 gauge iğneyi 28 gauge iğne ile değiştirin. 0.1 mL'lik bir enjeksiyon, böbreğe 2 x 105 hücre verir.
2. Cerrahi Alan Hazırlığı
- Bir ısıtma yastığının üzerine steril bir cerrahi örtü yerleştirerek biyogüvenlik kabininde steril bir cerrahi alan hazırlayın. Forseps, neşter, makas, göz damlası,% 5 povidon-iyot antiseptik ve steril gazlı bez dahil tüm malzemeleri toplayın. Kullanmadan önce tüm aletleri otoklavlayın.
- Ameliyatı aseptik uç tekniği kullanarak gerçekleştirin. Boncuk sterilizatörü ile hayvanlar arasındaki aletleri yeniden sterilize edin. Steril eldiven, laboratuvar önlüğü ve yüz maskesi kullanın.
3. Hayvan Hazırlama
- Fareleri kurumsal yönergelere göre ketamin / ksilazin (sırasıyla 87.5 mg / kg ve 12.5 mg / kg, ip) ile uyuşturun. Ayak parmağınızı kıstırarak anestezik derinliği belirleyin.
- Hayvanın tepkisiz olduğu kabul edildiğinde, kürkü kopararak (parmaklarla) veya tıraş ederek (makas kullanarak) Balb / c farelerinde enjeksiyon bölgesini (örneğin sol kanat) hazırlayın.
- Fareleri ameliyat hazırlık alanından (örn. muhafaza kafesi) cerrahi alana taşıyın ve kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün. Hazırlanan insizyon bölgesini %5 povidon-iyot antiseptik ile bolca sürün.
- Ameliyat öncesi analjezi olarak insizyonun yapılacağı bölgeye bupivakain hidroklorür (0.1 mL 2.5 mg / mL solüsyon, s.c.) enjekte edin.
- Peritona nüfuz etmeyecek şekilde steril bir neşter veya makas kullanarak hayvanın sol tarafında tek bir kesi (~ 1.0 ila 1.5 cm) yapın. Steril bir makasla dermisi peritondan ayırın. Kanı çıkarmak için kesi bölgesini steril pamuklu gazlı bezle silin.
- Fareyi iki elinizle tutun, başınızı tutmak için sol elinizi ve kanadı desteklemek için sağ elinizi kullanın.
- Dalağı peritondan tanımlayın ve sağ elin bir parmağıyla fareyi alttan palpe edin; böbrek şimdi peritondan görülebilmelidir. Periton ve böbrek boyunca gerginlik sağlamak için hayvanı sıkıca tutun.
- İkinci bir kişinin, 28 gauge iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanarak tümör hücrelerini (bölüm 1.2'de hazırlanan) sağlam peritondan böbreğin merkezine enjekte etmesini sağlayın. Yavaşça 0.1 mL (2 x 105) hücre verin. Hücreler enjekte edildikten sonra, hücrelerin geri akışını azaltmak için iğneyi 5-10 saniye yerinde tutun. Hücreleri enjekte eden kişi iğneyi fareyi tutan kişinin parmaklarına yaklaştıracağından, bu adım sırasında son derece dikkatli olunması gerektiğine dikkat etmek önemlidir.
- İğneyi çıkarın ve insizyonu ince bir siyanoakrilat doku yapıştırıcısı tabakası ile kapatın.
- Hayvanı steril bir kağıt havluyla temiz bir kafese geri koyun. Hayvanların bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin. İyileşme döneminde hayvanları gözetimsiz bırakmayın. Hayvanları dik ve sert olana kadar standart barınak koşullarına geri koymayın. Laboratuvar hayvanlarının kullanıldığı tüm prosedürlerde kurumsal yönergeleri izleyin.