Ters Fazlı Protein Dizileri Tabanlı Protein Ekspresyon Analizi: Hücre Lizatından Çoklu Proteinlerin Ekspresyonunun Eş Zamanlı Miktar Tayini İçin Bir Prosedür

Özet

Kaynak: O'Mahony, F. C. et al. Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde Protein İfadesi Varyasyonunu Keşfetmek için Ters Fazlı Protein Dizilerinin (RPPA) Kullanımı. J. Vis. Uzm. (2013)

Bu video, hücre lizatından protein ekspresyon modellerini incelemek için Ters Faz Protein Dizileri (RPPA) gerçekleştirme metodolojisini gösterir. RPPA'da, proteinlerin bir karışımını içeren lizat, nitroselüloz slaytlar üzerine basılır ve ilgilenilen proteinler, floresan etiketli antikorlar kullanılarak analiz edilir.

Protokol

1. RPPA Yazdırma

1. Protein lizatları, bir MicroGrid II robotik gözcü kullanılarak nitroselüloz kaplı cam slaytlar (Fastslides-Whatman) üzerinde tespit edildi. Kullanılan slaytlar, numunelerin lekelendiği 2 ped içeriyordu. Her ped aynı numunelerle, bu durumda 100 numunelerle tespit edildi. Diğer kullanılabilir biçimler arasında 1, 8 ve 16 ped slaytları bulunur. Ped sayısı ne kadar yüksek olursa, her birinde görülebilecek numune sayısı o kadar az olur.
2. Her numuneden beş adet 2 katlı seyreltme serisi yapıldı ve daha sonra her biri üç kopya halinde tespit edildi (numune başına toplam 15 nokta ile sonuçlandı).

Sonuçlar

Şekil 1. RPPA tarama işleminin akış diyagramı.

....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Triton X-100	Triton-X	T8787
Li-Cor Odyssey Engelleme Tamponu	Li-Kor	927-40000
MicroGrid II robot gözcü	Biyorobotik
FastFrame'in dört bölmeli sürgülü tutucusu	Ne adam	10486001
HIZLI Slayt - 2 Pedli	Ne adam	10485317
IRDye 680LT Keçi Anti-Fare IgG	Licor (Lisansör)	926-68020
IRDye 800CW Keçi anti-Tavşan IgG	Licor (Lisansör)	926-32211

Serisi Serisi