Ters Fazlı Protein Dizileri Tabanlı Protein Ekspresyon Analizi: Hücre Lizatından Çoklu Proteinlerin Ekspresyonunun Eş Zamanlı Miktar Tayini İçin Bir Prosedür

Abstract

Kaynak: O'Mahony, F. C. et al. Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde Protein İfadesi Varyasyonunu Keşfetmek için Ters Fazlı Protein Dizilerinin (RPPA) Kullanımı. J. Vis. Uzm. (2013)

Bu video, hücre lizatından protein ekspresyon modellerini incelemek için Ters Faz Protein Dizileri (RPPA) gerçekleştirme metodolojisini gösterir. RPPA'da, proteinlerin bir karışımını içeren lizat, nitroselüloz slaytlar üzerine basılır ve ilgilenilen proteinler, floresan etiketli antikorlar kullanılarak analiz edilir.

Protocol

1. RPPA Yazdırma

1. Protein lizatları, bir MicroGrid II robotik gözcü kullanılarak nitroselüloz kaplı cam slaytlar (Fastslides-Whatman) üzerinde tespit edildi. Kullanılan slaytlar, numunelerin lekelendiği 2 ped içeriyordu. Her ped aynı numunelerle, bu durumda 100 numunelerle tespit edildi. Diğer kullanılabilir biçimler arasında 1, 8 ve 16 ped slaytları bulunur. Ped sayısı ne kadar yüksek olursa, her birinde görülebilecek numune sayısı o kadar az olur.
2. Her numuneden beş adet 2 katlı seyreltme serisi yapıldı ve daha sonra her biri üç kopya halinde tespit edildi (numune başına toplam 15 nokta ile sonuçlandı).

2. RPPA Protein Tespiti

1. Fazla LiCor Engelleme Tamponunda ıslak slaytlar (PBS'de 50:50 oranında seyreltilmiş). Sallanan bir platformda RT'de 1 saat inkübe edin.
2. İstenilen konsantrasyonlarda LiCor Bloke Edici Tamponda (PBS'de 50:50 oranında seyreltilmiş) 800 μL primer antikor hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
3. Slaytları (i) tek çerçeveli Chip Clip'e veya (ii) 'FastFrame' dört yuvalı kayar tutucuya monte edin, böylece slayt ile inkübasyon haznesi arasında sıkı bir sızdırmazlık oluşur.
4. Artık tamponu kuyucuklardan çıkarın ve ilgili kuyucuklara 600 μL primer antikor ekleyin.
5. Sürgüyü ve hazneyi kapalı bir ıslak kutuya yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de sallanan platformda inkübe edin.
6. %0,1 PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μL Tween 20/100 mL PBS) oluşturur.
7. Slaytları soğuk odadan çıkarın ve birincil antikorları her bir oyuktan dikkatlice çıkarın.
8. 600 μL PBS-T ekleyin ve slaytları sallanan platformda RT'de 5 dakika (X3) yıkayın.
9. İlk etapta 1: 2.000 seyreltmede (1 μL / 2 mL) Odyssey Bloke Edici Tampon (PBS'de 50:50 seyreltilmiş)% 0.01 SDS içinde seyrelterek floresan etiketli ikincil antikorlar hazırlayın.
10. Tamponu kuyucuklardan çıkarın ve ilgili oyuklara 600 μL floresan etiketli ikincil antikorlar ekleyin. İkincil antikorları oda sıcaklığında hafifçe çalkalama ile 45 dakika inkübe edin; Membranı, nihayet taranana kadar ışıktan korumak önemlidir.
11. İkincil antikorları kuyudan çıkarın ve oda sıcaklığında 600 μL PBS-T'de kısaca (x3) yıkayın. Sürgüyü taşıyıcıdan çıkarın, uygun bir kaba aktarın ve fazla PBS-T'yi 15 dakika boyunca yıkayın, zarı karanlıkta tutun.
12. PBS-T'yi çıkarın ve kalan Tween-20'yi çıkarmak için membranı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS ile yıkayın ve membranı tekrar karanlıkta tutun.
13. Fastslide'ı 50 °C fırında 10 dakika kurutun ve ardından Li-Cor Odyssey tarayıcıda tarayın. Slaytı taranana kadar karanlıkta tutun.
14. Kullanılan ikincil antikor/antikorlara bağlı olarak slaydı 680 nm ve/veya 800 nm'de tarayın. İki renkli algılama için, çapraz reaktiviteyi en aza indirmek için her zaman yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikorlar kullanın. İki renkli tespit için primer ve sekonder antikorların dikkatli bir şekilde seçilmesi gereklidir. Birincil öneme sahip olan, iki birincil antikor için farklı konakçı türlerin (örneğin tavşan ve fare) seçilmesidir. Bu, kolayca ayırt edilebilir emisyon spektrumlarına sahip boya ile etiketlenmiş anti-tavşan ve anti-fare ikincil antikorları ile ayrımcılığa izin verir.
15. Görüntü dosyaları .tiff dosyaları olarak kaydedilir. Şekil 1, taranan dosyaların görüntüsünü göstermektedir.

Results

Şekil 1. RPPA tarama işleminin akış diyagramı.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triton X-100	Triton-X	T8787
Li-Cor Odyssey Engelleme Tamponu	Li-Kor	927-40000
MicroGrid II robot gözcü	Biyorobotik
FastFrame'in dört bölmeli sürgülü tutucusu	Ne adam	10486001
HIZLI Slayt - 2 Pedli	Ne adam	10485317
IRDye 680LT Keçi Anti-Fare IgG	Licor (Lisansör)	926-68020
IRDye 800CW Keçi anti-Tavşan IgG	Licor (Lisansör)	926-32211