Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Çözeltilerin Hazırlanması
- 5 L damıtılmış suda 73.0 g NaCl, 3.15 g KCl, 9.15 g CaCl2 ve 9.95 g MgS04'ü karıştırarak 50x stok E3 embriyo ortamı çözeltisi yapın ve RT'de saklayın.
- 5 L damıtılmış suda 73.0 g NaCl, 3.15 g KCl, 9.15 g CaCl2 ve 9.95 g MgS04'ü karıştırarak 50x stok E3 embriyo ortamı çözeltisi yapın ve RT'de saklayın.
- Zebra balığı embriyolarının kültürlenmesi için, E3 embriyo ortamı stoğunun 50x stok çözeltisini damıtılmış su ile 1x çalışma çözeltisine seyreltin, daha sonra bir mantar ilacı olarak işlev görmesi için her 1 L 1x E3'e 200 μl% 0.05 metilen mavisi ekleyin ve RT'de saklayın.
- 50x E3 stoğunun 40 mL'sini 0.06 mg PTU ile birleştirerek% 0.003 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) ile E3 embriyo ortamının pigmentasyon bloke edici bir çözeltisini yapın. Ardından hacmi damıtılmış su ile toplam 2 L'ye getirin.
- PTU tozunu çözelti haline getirmek için E3 / PTU O / N'yi RT'de karıştırın. Ardından, E3/PTU'yu RT.
not: E3 / PTU'nun raf ömrü yaklaşık bir haftadır ve daha eski solüsyonlar zebra balığı larvalarında pigmentasyon gelişimini engellemede daha az etkili olacaktır.
- 500 mL damıtılmış suya 1 g Trikain ekleyerek %0.2 Trikain (MS-222) içeren bir anestezik çözelti hazırlayın ve pH'ı 1 M Tris, pH 9.5 ile 7.2'ye ayarlayın.
2. Araçların Hazırlanması
- 5 "düz diseksiyon iğnesinin ucuna bir jel yükleme ucu takarak embriyoları mikroenjeksiyon için konumlandırmak için kullanılan bir embriyo manipülatör aleti hazırlayın ve bant veya süper yapıştırıcı ile sabitleyin.
- Önce ateşle parlatılmış 10 cm'lik filamentli bir borosilikat camı alete yerleştirerek bir iğne çektirmesi kullanarak mikroenjeksiyon iğneleri hazırlayın ve sapları sıkarak borosilikat camı sabitleyin.
- İnce konik iğneler oluşturmak için borosilikat camı çekin. Şu ayarları kullanın: ısı 540, çekme 245, hız 200 ve zaman 125.
- İğneleri bir Petri kabının içine yerleştirin, iğne uçlarını korumak için bir modelleme kili şeridine asın ve toz birikmesini önlemek için kabı kapalı tutun.
- İğneyi mikroenjeksiyonlar için hazırlamayı bitirmek için, yaklaşık 0,05-0,1 mm çapında keskin bir açısal enjeksiyon ucu oluşturmak için iğnenin çekilen ucunu kesmek için bir tıraş bıçağı veya ince forseps kenarı kullanın.
- Mikroenjeksiyon tepsisini yapmak için, 100 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde% 1.5'lik bir agaroz / E3 çözeltisi hazırlayın ve E3'ü bir mikrodalgada kaynatarak agarozu çözün ve ardından RT'de yaklaşık 10 dakika soğumaya bırakın.
- Yaklaşık 0,5 cm derinliğinde bir temel oluşturmak için soğutulmuş agaroz/E3 solüsyonunu bir Petri kabına dökün. Bu katılaştığında, yaklaşık 0,3 cm derinliğe sahip ikinci bir tabaka dökün ve prefabrike embriyo kuyusu kalıbını yerleştirin ve agarozun RT.
'da katılaşmasına izin verin
not: Kalıbı üst agar/E3 katmanına yerleştirirken, kalıbı hava kabarcıklarının sayısını azaltacak bir açıyla agarın içine yerleştirin.
- Tüm mikroenjeksiyon tepsisi sertleştiğinde, prefabrike embriyoyu bir kepçe kullanarak yavaş ve dikkatli bir şekilde kalıplayın, ardından tabağı E3 solüsyonu ile doldurun ve 4 ° C'de saklayın.
3. Nefrotoksin çözeltisinin mikroenjeksiyonu
- Enjeksiyon gününde, uygun araç kontrolü ile birlikte istenen nefrotoksin solüsyonunu hazırlayın.
- İlaç(lar)ın çözelti içinde olduğundan emin olmak için hafifçe girdap yapın veya karıştırın, tüpün kenarlarını ve su sütununun üstünü kontrol edin.
not: Nefrotoksin çözeltileri, mikroenjeksiyon etkinliğini izlemek ve ayrıca sonraki zaman noktalarında böbrek klerensini değerlendirmek için eser miktarda floresan konjuge dekstran içerecek şekilde hazırlanabilir.
- İğnenin arkasına ince bir jel yükleme ucu geçirerek ~ 2-3 μL nefrotoksin içeren kesilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin ve çözeltinin kesilmiş iğne ucunu yerçekimi ile doldurmasına izin vermek için iğneyi bir parça bantla dikey olarak askıya alın.
- İğne ucu dolduğunda, yüklü iğneyi mikromanipülatöre sabitleyin.
- Bir mikrometre lamına bir damla mineral yağ koyarak mikroenjeksiyon hacmini test edin ve damlacık boyutunu değerlendirmek için yağa enjekte edin. 500 pl'lik bir enjeksiyon hacminin çapı 0.1 mm'dir.
- Embriyo kabını inkübatörden çıkarın ve embriyo kabına yaklaşık 5 mL% 0.2 Trikain ekleyerek anestezi uygulayın.
- Tam anesteziyi sağlamak için, embriyo manipülatör aletinin ucuyla embriyoya hafifçe dokunun. Hareket eksikliği yeterli anesteziyi gösterir.
- Başarılı bir anesteziden sonra, embriyoları bir transfer pipeti ile enjeksiyon kalıbına aktarın.
- Her embriyoyu kalıbın farklı bir kuyucuğuna doğru hareket ettirin, kafayı kuyunun en derin bölgesine yerleştirin, böylece gövde çöküntü boyunca dinlenir ve kuyruk çöküntüden dışarı çıkar.
- Doldurulmuş iğneyi mikromanipülatöre yerleştirin ve iğne ucunu bir embriyonun yanına yerleştirin.
- Joystick'i ileri doğru hareket ettirerek iğneyi yavaşça kuyruk kabına sokun ve mikroenjeksiyonu sağlamak için ayak pedalına basın.
not: Başarılı enjeksiyon, sıvının dolaşıma girmesi izlenerek ölçülebilir. Ayrıca, nefrotoksiktanın floresan konjuge dekstran ile birlikte enjeksiyonu, araştırmacının prosedürden sonra başarılı enjeksiyonu doğrulamasını sağlar.
- İğneyi embriyodan çıkarmak için joystick'i yavaşça geri çekin.
- Enjeksiyondan sonra, embriyoları temiz bir tabağa aktarın ve Trikaini çıkarmak için durulayın ve taze E3 / PTU ile değiştirin.
- Metilselüloz montaj ortamında fotoğrafla belgelenebilen morfolojiyi değerlendirmek için embriyoyu istenen zaman noktasına kadar inkübe edin veya istenildiği gibi deneysel analiz için işlem yapın.
not: Embriyoların iyileşmesi, genellikle böbrek hasarını gösteren ödemli bireylerin yüzdesini belirlemek için değerlendirilmelidir.
