Böbrek Düz Montaj Hazırlığı: Yetişkin Zebra Balığı Böbreğinin Mikroskobik Analizi için Düz Bir Montajın İncelenmesi ve Hazırlanması Prosedürü

Özet

Kaynak: McCampbell, K. K. et al. Yetişkin Zebra Balığı Böbreğinde Nefron Bileşimi ve İşlevinin Analizi.J. Vis. Uzm. (2014)

Bu video, yetişkin zebra balığı böbreğinin düz bir montajının diseksiyonunu ve hazırlanışını göstermektedir. Hazırlanan düz montaj, numune analizi için mikroskop altında görselleştirilebilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Proksimal Tübülün Floresan Dekstran Etiketlemesini Görselleştirmek için Sabitlenmemiş Bir Hayvan Örneğinden Yetişkin Zebra Balığı Böbreğinin Diseksiyonu ve Düz Montaj Hazırlığı

1. Dekstran enjekte edilen yetişkin zebra balığını 4-5 dakika boyunca %0,2 Trikain pH 7.0 olan bir tabağa koyarak ötenazi yapın.
   not: Solungaçların hareketinin durup durmadığını ve kalbin atmayı bırakıp bırakmadığını dikkatlice izleyerek devam etmeden önce balığın ötenazi yapıldığından emin olun.
2. Plastik bir kaşık kullanarak, balığı Trikain çözeltisinden kaldırın, çözeltiyi boşaltın ve hayvanı bir mendil veya kağıt havlu üzerine koyun.
3. Solungaç operkulumunun arkasını kesmek için keskin bir çift diseksiyon makası kullanın ve kafayı çıkarın.
4. Baştan kuyruk yüzgecinin tabanına kadar uzun bir ventral kesi yaparak balığın gövdesini diseksiyon makasıyla hemen açın.
5. Bir çift ince forseps kullanarak balığın iç organlarını çıkarın.
6. Hayvanın sırt duvarına yapışık olan böbrek organının görüntülenmesini sağlamak için vücut duvarlarını açmak için süper ince diseksiyon iğneleri kullanın.
7. Böbreği sırt duvarından ayırmak için ince forseps kullanın.
8. Böbreği nazikçe 1X PBS içeren 5 mL'lik bir cam şişeye yerleştirin ve her biri 5 dakika boyunca 3-5 mL taze 1X PBS ile 3 kez yıkayın.
   not: Yetişkin böbrek örneklerinin işlenmesi için bir cam şişenin kullanılması, dokunun görselleştirilmesini kolaylaştırır ve yaklaşık 3-5 mL'lik büyük hacimli (doku kütlesine göre) yıkamalara izin verir. Alternatif olarak, 12 oyuklu bir hücre kültürü kabı kullanılabilir. Plastik bir mikrosantrifüj tüpü kullanılabilirken, standart boyutlu tüpler (1.5 mL) yıkamayı kısıtlayabilir.
9. Böbreği bir transfer pipeti ile çıkarın ve 1-2 damla 1X PBS içeren temiz bir cam slayt üzerine yerleştirin.
10. İnce forseps kullanın, böbreği slayt üzerinde düzleştirin, hiçbir dokunun kendi üzerine kıvrılmadığından veya başka bir şekilde devrilmediğinden emin olun.
    not: Alternatif olarak, böbreğin düzleştirilmiş konumlandırılmasını kolaylaştırmak için bağ dokusunda küçük kesiler yapmak için bir tungsten tel aleti kullanılabilir.
11. 18 x 18 mm'lik bir cam lamellerin her bir köşesine küçük modelleme kili parçaları yerleştirin ve lamel yavaşça böbreğin üzerine yerleştirin.
    not: Çözeltideki hava kabarcıklarının sıkışmasını en aza indirmek için yerleştirme sırasında lameli hafifçe açın. Modelleme kil çukurları yaklaşık 2 mm çapındadır (Şekil 1A). Alternatif olarak, modelleme kili yerine vakumlu gres dipotları ikame edilebilir. Gerekirse lamel ile cam sürgü arasındaki boşluğu doldurmak için ek bir damla 1X PBS ekleyin.
12. Cam slaytı uygun filtre ile bir stereomikroskop veya bileşik mikroskop üzerinde görüş alanına yerleştirerek böbreği gözlemleyin ve/veya görüntüleyin.

Sonuçlar

Şekil 1. Yetişkin zebra balığı böbrek düz montaj hazırlığı ve böbrek nefronların PCT segmentinde konjuge dekstran alımını görselleştirmek için uygulama. (Bir)Organın bir cam slayt üzerine düz bir şekilde yerleştirildiği, dört adet modelleme kili (sıcak pembe renk) üzerinde duran dokunun üzerine bir lamel yerleştirilmiş bir lamel ile bir böbrek örneği düz montaj hazırlığının parlak alan görüntüsü. Bura...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 adet PBS			10 X PBS'nin damıtılmış suda seyreltilmesiyle yapılır.
İnce Forseps	Roboz Belediyesi	RS-1050	Dumont Cımbız Kalıbı #55
Cam kaydırak	Termo-Balıkçı	4445	Beyaz Don
Cam lamel	Termo-Balıkçı	12-540Bir	18 x 18 mm
Kil modelleme	Hasbro Belediyesi	Playdoh Belediyesi	Diğer modelleme killeri ikame edilebilir ve benzer şekilde çalışabilir.
Slayt tutucu	Termo-Balıkçı	12-587	İsteğe bağlı: slaytları düz tutmak için karton tepsi.
Stereomikroskop	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Mavi GFP/DAPI; 83457 P-Bağış GFP/ FITC; 83457 P-TRITC	Kullanılan filtre seti şu şekildeydi: DAPI, propidium iyodür, dekstran-kaskad mavisi ve alkalin fosfataz tespiti için Hoechst/DAPI filtresi kullanıldı. Dekstran-FITC, dekstran lucifer sarısı ve antiGFP tespiti için GFP/FITC filtresi kullanıldı. TRITC filtresi, dekstran-floro-yakut, PI ve DBA tespiti için kullanıldı.
Bileşik mikroskop	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Teksas Kırmızısı	Kullanılan filtre seti şu şekildeydi: DAPI, propidium iyodür, dekstran-kaskad mavisi ve alkalin fosfataz tespiti için Hoechst/DAPI filtresi kullanıldı. Dekstran-FITC, dekstran lucifer sarısı ve antiGFP tespiti için GFP/FITC filtresi kullanıldı. Texas Red filtresi, dekstran-floro-yakut, PI ve DBA tespiti için kullanıldı.