$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Yetişkin Zebra Balığı Böbreğinin Fiksasyonu, Diseksiyonu, Geçirgenliği ve Pigmentasyonunun Giderilmesi
- % 4 paraformaldehit (PFA) / 1X PBS /% 0.1 DMSO'dan oluşan taze bir fiksatif çözelti hazırlayın ve% 4 PFA / 1X PBS'lik donmuş bir alikotu çözün ve% 0.1 DMSO.
ekleyin
DİKKAT: PFA toksiktir ve PFA çözeltileri, eldivenler ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyilirken kimyasal bir başlıkta kullanılmalıdır. Ek olarak, stok çözeltisi yapılırken PFA tozu dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır.
- Tüm hayvanı batırmak için bir diseksiyon tepsisini yeterli fiksatif solüsyonla doldurun.
- Seçilen zebra balığını ötenazi yapın ve fiksasyon solüsyonuna monte edin.
not: Seçilen balık, tedavi edilmemiş bir zebra balığı böbrek örneği veya daha önce intraperitoneal dekstran enjeksiyonu yapılmış bir zebra balığından izole edilmiş bir böbrek olabilir.
- Numuneyi sabitleyin O/N (12–16 saat) 4 oC'de.
- Ertesi gün, böbreği sırt vücut duvarından dikkatlice ayırmak için ince forseps kullanın ve organı bir transfer pipeti kullanarak bir cam şişeye yerleştirin.
NOT: Alternatif olarak, 12 oyuklu veya 24 oyuklu bir kültür kabı kullanılabilir. Plastik bir mikrosantrifüj tüpü kullanılabilirken, standart boyutlu tüpler (1,5 mL) yıkamayı kısıtlayabilir.
- Diseke edilen böbreği 3 kez 3-5 mL 1X PBS ile %0.05 Tween ile 5 dakika yıkayın.
- 1X PBS'yi %0.05 Tween ile çıkarın ve böbreği 3 mL %5 sükroz solüsyonu (1X PBS'de) ile 30 dakika durulayın.
- 3 mL% 30 sükroz çözeltisi (1X PBS'de) ile değiştirin ve O / N'yi (12-16 saat) 4 oC'de saklayın < br / >
NOT: Sükroz çözeltileri hücresel zarlara nüfuz eder ve daha sonra dokuya nüfuz ederken reaktiflerin spesifik olarak etiketlenmesine izin verir.
- Ertesi gün,% 30 sükroz çözeltisini çıkarın ve böbreği her biri 5 dakika boyunca% 0.05 Tween ile 5 mL 1X PBS ile 2 kez yıkayın.
- Böbrek organında bulunan melanosit pigmentasyonunu gidermek için 1X PBS'yi %0.05 Tween ile 3-5 mL ağartma solüsyonu ile değiştirin.
- Cam şişeyi bir döndürücüye yerleştirin ve pigmentasyonun kaybolmasını dikkatlice izleyin.
NOT: Depigmentasyon, sükroz tedavisinden sonra yapıldığında tipik olarak yaklaşık 20 dakika sürer, ancak bazen 60 dakika kadar sürebilir. Beyazlatma solüsyonu böbrekte çok uzun süre bırakılırsa, organın parçalanması meydana gelebilir; Doku bütünlüğünü kontrol etmek için numunenin her 10-15 dakikada bir izlenmesi tavsiye edilir.
- Pigmentasyon böbrekten çıkarıldığında,% 0.05 Tween ile 3-5 mL 1X PBS ile iki kez yıkayın.
- 1X PBS'yi RT'de 1 saat boyunca 3-5 mL %4 PFA çözeltisi ile %0,05 Tween ile değiştirin.
- % 4 PFA çözeltisini çıkarın ve böbreği 3 kez% 0.05 Tween ile 3-5 mL 1X PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın.
NOT: Fiksasyon tamamlandıktan sonra, böbrek ayrıca bir cam slayt üzerine monte edilebilir ve melanosit pigmentasyonu olmadan dekstran alımı açısından değerlendirilebilir.
- 1X PBS'yi %0.05 Tween ile çıkarın ve 3-5 mL bloke edici solüsyon ile değiştirin, ardından böbreği blokta RT'de 2 saat inkübe edin.
- Engelleme tamamlandığında, doğrudan seçilen boyama protokolüne ilerleyin.
NOT: Böbrek, farklı reaktiflerle etiketleme çalışmaları yapmak için artık bir veya daha fazla başka prosedürle işlenebilir.