Genişleme Patolojisi: Klinik Doku Örneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Optik Görüntülenmesi İçin Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Klimas, A. et al. Fiziksel ve İzotropik Genişleme Yoluyla İnsan Doku Kesitlerinin Nanoskopik Görüntülenmesi.J. Vis. Uzm.(2019)

Bu videoda, klinik doku örneklerinin nano ölçekli yapıların mikroskobik incelemesi için bir polimer ağı kullanılarak kimyasal olarak genişletildiği, genişleme mikroskobunun bir çeşidi olan genişleme patolojisi adı verilen bir yöntemi açıklıyoruz.

Protocol

1. Numunelerin Yerinde Polimerizasyonu

1. Numuneyi bir ankraj çözeltisi içinde inkübe edin.
   1. AcX stok çözeltisini 1x PBS'de aldehit olmayan fiksatiflerle sabitlenmiş numuneler için 0.03 mg/mL'lik bir konsantrasyona seyrelterek veya AcX ile reaksiyona girecek daha az serbest amin içeren aldehit fiksatiflerle sabitlenmiş numuneler için 0.1 mg/mL'ye seyrelterek ankraj solüsyonunu hazırlayın (tipik olarak doku bölümünü kaplamak için 250 μL yeterlidir).
   2. Slaytı 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve sabitleme solüsyonunu doku üzerine pipetleyin. RT'de en az 3 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
2. Numuneleri jelleşme çözeltisi içinde inkübe edin.
   1. En az 100 kat fazla hacimde jelleşme solüsyonu hazırlayın. 200 μL başına, aşağıdakileri sırayla birleştirin: 188 μL monomer çözeltisi, 4 μL %0.5 4HT stok çözeltisi (1:50 seyreltme, nihai konsantrasyon: %0.01), 4 μL %10 TEMED stok çözeltisi (1:50 seyreltme, nihai konsantrasyon %0.2) ve 4 μL %10 APS stok çözeltisi (1:50 seyreltme, nihai konsantrasyon %0.2).
      NOT: Jelleşme solüsyonu kullanımdan hemen önce yapılmalıdır. Çözelti 4 ° C'de tutulmalı ve erken jelleşmeyi önlemek için APS çözeltisi en son eklenmelidir.
   2. Fazla solüsyonu doku bölümünden çıkarın ve slaytı 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Numuneye taze, soğuk jelleştirici solüsyon ekleyin ve solüsyonun dokuya difüzyonunu sağlamak için karışımı doku üzerinde 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
3. Jelleşme solüsyonunu bozmadan, numunenin etrafındaki slayt üzerinde bir oda oluşturun (Şekil 1A).
   1. Elmas bir bıçak kullanarak kapak camı parçalarını ince bir şekilde keserek jelleşme odası için ara parçalar yapın.
      NOT: Genişleme sonrası görüntülemeyi kolaylaştırmak için, doku üzerindeki boş jel miktarını azaltmak için ara parçaların kalınlığı doku örneğine yakın olmalıdır. Standart klinik numuneler (5-10 μm) için 1,5 numara cam kullanılabilir. Daha kalın numuneler için kapak camı parçaları istiflenebilir.
   2. Su damlacıkları (~ 10 μL) kullanarak dokunun her iki tarafındaki ara parçaları sabitleyin.
   3. Doku üzerinde hava kabarcıkları oluşmamasını önleyerek sürgünün üzerine dikkatlice bir kapak cam kapağı yerleştirin (Şekil 1B).
4. Numuneyi 37 °C'de nemlendirilmiş bir ortamda (nemli bir mendille kapalı bir Petri kabı gibi) 2 saat
   inkübe edin NOT: Protokol buradan duraklatılabilir. Kaydırma haznesi, 4 °C'de kapalı bir Petri kabı içinde saklanabilir.

2. Örnek Sindirim

1. Bir tıraş bıçağını lamelin altına hafifçe kaydırarak ve lameli jel yüzeyinden yavaşça kaldırarak jelleşme haznesinin kapağını çıkarın. Hacmi en aza indirmek için boş jeli dokunun etrafına kesin. Homojenizasyondan sonra jelin yönünü izlemek için jeli asimetrik olarak kesin, çünkü numune şeffaf hale gelecektir.
   1. Kullanmadan önce ProK'yi sindirim tamponunda (son konsantrasyon 4 U/mL) 1:200 oranında seyreltin. Jeli tamamen batırmak için yeterli çözelti hazırlayın; dört oyuklu bir plastik hücre kültürü plakasının tek bir oyuğu, oyuk başına en az 3 mL gerektirir.
   2. Numuneyi, sindirim tamponu içeren kapalı bir kapta 60 °C'de 3 saat inkübe edin. Numune sindirim sırasında slayttan ayrılmazsa, numuneyi nazikçe çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın.
      NOT: Numunenin kurumasını önlemek için numune tamamen sindirim tamponuna daldırılmalı ve film ile kapatılabilen kapalı bir kaba (küçük sürgülü kutu, plastik kuyu, Petri kabı vb.) yerleştirilmelidir.

3. Örnek Genişletme ve Görüntüleme

1. Numuneyi, istenen görüntüleme sistemiyle uyumlu ve tamamen genişlemiş jeli barındıracak kadar büyük bir kapta 1x PBS'ye aktarmak için yumuşak bir boya fırçası kullanın. Görüntüleme objektifi ile numune arasındaki mesafeyi en aza indirmek için, ters çevrilmiş bir sistemde görüntüleniyorsa dokunun numune tarafı aşağı bakacak şekilde veya dik bir sistemde görüntüleniyorsa yukarı bakacak şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Gerekirse yumuşak bir boya fırçası kullanarak jeli çevirin.
   not: Bir LED'den gelen yan aydınlatma, onları sıvı içinde görünür kılmak için kullanılabilir. Standart bir 6 oyuklu plaka, önceden genişletilmiş çapı 0,6 cm'den az olan numuneleri barındırabilir. Ters çevrilmiş bir sistemde görüntüleme için cam tabanlı bir kuyu plakası kullanılmalıdır.
2. Numuneleri RT'de 1x PBS'de 10 dakika yıkayın. İstenirse, sindirim işlemi DAPI lekesini yıkarken numuneyi 300 nM DAPI ile yeniden boyayın. PBS'yi çıkarın ve RT'de 20 dakika boyunca 1x PBS ile seyreltilmiş 300 nM DAPI ile lekeleyin, ardından RT.
   'de 1x PBS ile 10 dakika yıkayın NOT: Numuneler 1x PBS ile kaplanabilir ve bir sonraki adıma geçmeden önce 4 °C'de saklanabilir.
3. Numuneleri genişletmek için, PBS'yi değiştirin ve RT.
   'de her biri 10 dakika boyunca 3-5 kez fazla miktarda ddH₂O (son jel hacminin en az 10 katı) ile yıkayın. not: 3^{. veya 4. yıkamadan} sonra, numunenin genişlemesi plato haline gelmeye başlamalıdır. Depolama için, bakteri üremesini önlemek için, ddH₂O% 0.002 -% 0.01 sodyum azid (NaN₃) ile desteklenebilir. Bu durumda, nihai genleşme faktörü geri dönüşümlü olarak %10 oranında azaltılır.
4. Geleneksel bir geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskop veya tercih edilen başka bir görüntüleme sistemi kullanarak floresan görüntüleme gerçekleştirin.
   not: Jellerin sürüklenmesini önlemek için, fazla sıvı kuyudan çıkarılabilir. Jeller ayrıca %1.5-2 düşük erime noktalı agaroz ile hareketsiz hale getirilebilir. Çözelti hacminin 2-4 katı bir kapta su içinde %1.5−2 (a/h) düşük eriyik agaroz hazırlayın. Çözeltiyi eritmek için çözeltiyi 40 °C'lik bir su banyosunda veya mikrodalgada 10-20 saniye ısıtın. Erimiş agarozu jelin kenarlarına pipetleyin. Agarozun RT veya 4 °C'de sertleşmesine izin verdikten sonra, dehidrasyonu önlemek için numuneye su ekleyin.

Results

Şekil 1: Patoloji örnekleri için jelleşme odası. (A) Elmas bıçakla kesilmiş iki parça # 1.5 kapak camı gibi iki ara parça, numuneyi 4 ° C'de jelleşme çözeltisi içinde inkübe ettikten sonra dokunun her iki tarafına yerleştirilir. Numunenin sıkışmasını önlemek için ara parçalar doku dilimlerinden daha kalın olmalıdır. (B) 37 ° C'de inkübasyondan önce nu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 kuyulu cam tabanlı plaka (# 1.5 kapak camı)	Cellvis (Cellvis Çiçeği)	P06-1.5H-N
aseton	Fischer Bilimi	A18-500
Akrilamid	Sigma Aldrich	A8887
Akriloyl-X SE, (AcX)	Canlandırıcı	A20770
agaroz	Fischer Bilimi	BP160-100
Amonyum persülfat (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Başlatıcı
DAPI (1 mg / mL)	Termo Bilimsel	62248	Nükleer leke
Elmas bıçak No. 88 CM	Genel Araçlar	31116
etanol	Eczacılık	111000200
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 0,5 M	VWR (VWR)	BDH7830-1
FFPE Böbrek Örneği	USBiomax (USBiomaks)	HuFPT072
Forseps
Mikro kapak Cam #1 (24 mm x 60 mm)	VWR (VWR)	48393 106
Mikro kapak Cam #1.5 (24 mm x 60 mm)	VWR (VWR)	48393 251
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamin (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	hızlandırıcı
N, N' - Metilenbisakrilamid	Sigma Aldrich	M7279
Nunclon 6 Kuyulu Hücre Kültürü Kabı	Termo Balıkçı	140675
Nunc 15 mL Konik	Termo Balıkçı	339651
Nunc 50 mL Konik	Termo Balıkçı	339653
Yörünge Çalkalayıcı
Boya fırçası
pH Ölçüm Cihazı
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) 10x Çözelti	Fischer Bilimi	BP399-1
Plastik Petri Kabı (100 mm)	Fischer Bilimi	FB0875713
Proteinaz K (Moleküler Biyoloji Sınıfı)	Termo Bilimsel	EO0491
Tıraş bıçağı	Fischer Bilimi	12640
Safelock Mikrosantrifüj Tüpleri 1.5 mL	Termo Balıkçı	3457
Safelock Mikrosantrifüj Tüpleri 2.0 mL	Termo Balıkçı	3459
Sodyum akrilat	Sigma Aldrich	408220
Sodyum klorür	Sigma Aldrich	S6191 Serisi
Sodyum sitrat tribazik dihidrat	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Tris Tabanı	Fischer Bilimi	BP152-1
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Ksilen	Sigma Aldrich	214736